МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 5, с. 765-771
К 70-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ ^^^^^^^^^^ А.Д. МИРЗАБЕКОВА
УДК 577.2
ВКЛАД ЛАБОРАТОРИИ А. Д. МИРЗАБЕКОВА В ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА МЕТОДОМ ДНК-БЕЛКОВЫХ СШИВОК
© 2007 г. О. В. Преображенская1*, В. Л. Карпов1, А. М. Колчинский2
1Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
2Health Front Line, Ltd., Champaign, IL, 61821, USA Поступила в редакцию и принята к печати 02.04.2007 г.
Представлен обзор работ А.Д. Мирзабекова и сотрудников его лаборатории по структуре хроматина. Описаны разработанные в лаборатории методы ковалентной пришивки белков хроматина к ДНК с последующим анализом продуктов сшивок и локализации контактов в молекулах ДНК и индивидуальных белков. Этот оригинальный подход сыграл важную роль в установлении молекулярной структуры нуклеосом и позволил исследовать структурные переходы в хроматине при активации генов.
Ключевые слова: хроматин, гистоны, негистоновые белки, ДНК-белковые сшивки, транскрипция.
THE LEGACY OF ANDREY MIRZABEKOV AND HIS LABORATORY IN THE STUDIES OF CHROMATIN STRUCTURE USING DNA-PROTEIN CROSS-LINKING, by O. V. Preobrazhenskaya1*, V. L. Kar-pov1, A. M. Kolchinsky2 ^Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117984 Russia, *e-mail: preobr@eimb.ru; 2Health Front Line, Ltd., Champaign, IL, 61821, USA). The work of A.D. Mirzabekov and his collaborators on chromatin structure is reviewed. The methods of DNA-protein covalent binding with subsequent analysis of cross-linked products developed in the laboratory were used to localize the contacts in both DNA and individual proteins. This original approach played an important role in the deciphering of the molecular structure of nucleosome. In addition, it made possible the investigation of structural transitions in chromatin upon gene activation.
Key words: chromatin, histones, non-histone proteins, DNA-protein cross-linking, transcription.
К 1972 г. цикл работ А.Д. Мирзабекова в лаборатории A.A. Баева по структурно-функциональному исследованию валиновых тРНК был завершен, А.Д. Мирзабеков защитил докторскую диссертацию, и В.А. Энгельгардт принял решение о его назначении заведующим лабораторией. Это решение было поддержано Ученым советом Института молекулярной биологии АН СССР в начале 1973 г.
В проекте работы будущей лаборатории, составленном в 1972 г., А.Д. Мирзабеков так сформулировал ее задачи: "Организуемая лаборатория будет характеризоваться четко выраженным структурным уклоном, проявляемым в исследованиях низших уровней организации и функционирования хромосом". Обдумывая возможные подходы к поставленной задаче, Мирзабеков с особым вниманием читал недавно вышедшую монографию Н.К. Кочеткова и соавт. "Органическая химия нуклеиновых кислот" [1]. Андрей Дарьевич, имея хорошее химическое образование, мыслил, прежде всего, как химик, стремясь использовать опыт,
* Эл. почта: preobr@eimb.ru
накопленный при изучении структуры тРНК с помощью молекулярных проб - как химических, так и ферментативных.
В то время для исследования состояния ДНК в хроматине перспективным химическим зондом представлялся диметилсульфат (ДМС). Эта небольшая молекула реагирует в ДНК с атомами N7 гуанина, N3 и N1 аденина. Первый из них находится в большой бороздке ДНК, второй - в малой, а N1 аденина подвергается метилированию ДМС только в одноцепочечной ДНК. Модифицированные ДМС основания более устойчивы к апуринизации, чем при модификации их более крупными остатками, например, диэтилсульфа-том, и в то же время их легко подвергнуть избирательному отщеплению.
В 1972 г. о молекулярной структуре хроматина было известно очень немногое (об истории исследования хроматина см. обзор Олинса и Олинс [2] и приведенные в нем ссылки). Было неясно, каково взаимное расположение ДНК и белков в хро-матиновой фибрилле. (Напомним, что термин "нуклеосома" появился только в 1975 г.)
Андрей Дарьевич Мирзабеков в лаборатории Молекулярной организации хромосом. Расшифровка структуры нуклеосом (конец 70-х гг.).
В начале 1973 г. А.Д. Мирзабеков предложил использовать ДМС в качестве пробы на состояние ДНК в составе хроматина, в частности, для определения относительной доступности большой и малой бороздок ДНК. Одновременно было решено исследовать комплексы ДНК с дистамицино-выми антибиотиками, которые, согласно принятой модели, связываются с малой бороздкой ДНК. Эта работа велась вместе с А.С. Заседателевым, Г.В. Гурским и другими сотрудниками лаборатории М.В. Волькенштейна в ИМБ АН СССР, пионерами в этой области. Начались опыты по модификации ДНК в комплексах с антибиотиками, с положительно заряженными белками и с хроматином.
Были получены существенные результаты. Во-первых, было показано, что метод работает: ли-ганды, расположение которых в бороздках ДНК было известно, экранировали соответствующие атомы от метилирования [3]. Во-вторых, ДНК в составе хроматина оказалась полностью доступна для взаимодействия с ДМС [4]. Это выглядело несколько парадоксальным, но соответствовало данным некоторых других лабораторий, которые показывали, что ДНК в хроматине доступна для взаимодействия с различными агентами, например, с полилизином и нуклеазами.
Летом 1974 г. А.Д. Мирзабеков вошел в состав редколлегии только что организованного международного журнала "Molecular Biology Reports", куда и были направлены статьи по использованию ДМС в качестве химического зонда ДНК [4, 5]. Это были первые статьи Лаборатории молекулярной организации хромосом, и они положили начало широкому использованию ДМС в исследованиях самых разнообразных комплексов ДНК.
При публикации этих статей произошел досадный казус: редакция спутала титульные страницы и, в результате, заголовки и авторы статей не соответствовали текстам. К счастью, статьи были опубликованы в одном номере, так что читатели сами могли разобраться в этой путанице.
В феврале 1975 г. А. Мирзабеков посетил в Гарвардском университете (США) лабораторию Уолтера Гилберта, который в то время пытался использовать ДМС для исследования взаимодействия Lac-репрессора с соответствующим оператором. В результате интенсивного обмена идеями лаборатория У. Гилберта смогла достичь значительных успехов в своих опытах, и участки взаимодействия белка с оператором были определены с точностью до нуклеотида. Кроме того, впервые была показана возможность "химического" секвенирования ДНК.
При публикации этих результатов У. Гилберт включил А.Д. Мирзабекова в качестве соавтора в материалы конференции в Дании [6], однако ни в одной из последующих статей на эту тему его не было в числе соавторов. Многие крупные молекулярные биологи США, близко знакомые с событиями тех лет, до сих пор считают, что вклад Мирзабекова в разработку "химического" секвенирования не получил должной оценки. Об этом пишет и Р. Кук-Диган в известной монографии об истории секвенирования генома человека [7].
В 1975 г. сотрудники Мирзабекова обнаружили, что реакция ДНК с ДМС идет в замороженных растворах и суспензиях при температуре -20°С, причем ее скорость на порядок больше, чем в растворе при 0°С. Это неожиданное и важное наблюдение позволило исследовать состояние ДНК в целых клетках без предварительного выделения хроматина. Оказалось, что ДМС легко диффундирует в замороженные клетки, и при этом общая картина модификации ДНК в клетке сходна с картиной, наблюдавшейся при исследовании выделенного хроматина. Соответствующие результаты вошли в итоговую статью по использованию ДМС в качестве химического зонда хроматина [8].
В дальнейшем ДМС и другие алкилирующие агенты получили широкое распространение при изучении ДНК-белковых взаимодействий. Различные варианты этого подхода основаны на экранировании ДНК от метилирования или, наоборот, на ингибировании связывания белка после модификации определенных оснований в участке узнавания.
Одновременно с использованием ДМС в качестве пробы, в лаборатории А.Д. Мирзабекова разрабатывалась другая его идея, основанная на взаимодействии ДМС с ДНК. Метилирование пуринов облегчает их отщепление; при этом на месте апуринизации остается активная альдегидная группа. Предполагалось, что эта альдегидная
группа может образовать основание Шиффа с одной из первичных аминогрупп белка и, после восстановления боргидридом, может возникать прочная ковалентная связь. При этом считалось, что молекула ДНК разорвется по месту пришивки и белок окажется на ее З'-конце. Таким образом, длина пришитого фрагмента ДНК должна соответствовать расстоянию от его фиксированного конца до места взаимодействия с белком.
Важно отметить, что образующаяся активная группа, обеспечивающая ковалентную связь с белком, находится в сахарофосфатном остове ДНК и реагирует с активными группами в самом белке без дополнительной модификации, т.е. образующиеся сшивки имеют "нулевую длину" и отражают непосредственную близость участвующих в них молекул.
Первая статья лаборатории А.Д. Мирзабекова, демонстрирующая возможность такого подхода, опубликована в декабре 1975 г. [9]. Идея была подхвачена Р. Симпсоном (Национальные институты здоровья, США), который узнал о ней из опубликованной статьи и из одного из докладов А. Мирзабекова. В декабре 1976 г. Симпсон опубликовал свои результаты [10]. Как оказалось впоследствии, эта публикация содержала существенные ошибки, тем не менее она послужила для Мирзабекова и его сотрудников стимулом для ускоренной разработки анализа сшитых ДНК-белковых комплексов с помощью двумерного электрофореза.
Принцип этого метода состоял в следующем. После ограниченной сшивки гистонов с ДНК полученный материал метили по тирозиновым остаткам белков радиоактивным иодом или по 5'-концам ДНК радиоактивным фосфором (с помощью [у-32Р]-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы). Сшитые комплексы разделяли в первом направлении в присутствии SDS в соответствии с суммарными размерами белка и ДНК. Далее опыт мог идти по одному из двух направлений.
Для анализа пришитых фрагментов ДНК помеченный 32Р материал разделяли в полиакрил-амидном геле и затем белки удаляли из геля первого направ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.