БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с.1102-1108
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
ВКЛАД ПРОТЕИНКИНАЗЫ1 С И ЯЬо-КИНАЗЫ В РЕГУЛЯЦИЮ РЕЦЕПТОР-ЗАВИСИМОГО СОКРАЩЕНИЯ АРТЕРИЙ УМЕНЬШАЕТСЯ С ВОЗРАСТОМ И НЕ ЗАВИСИТ ОТ СИМПАТИЧЕСКОЙ ИННЕРВАЦИИ
**
j
© 2008 г. C.B. Мочалов*, В.У. Каленчук**, Д.К. Гайнуллина*, А.В. Воротников
O.C. Тарасова* ***
*
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991,
Москва, Воробьевы горы, 1, стр.12;
*
Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119192, Москва, Ломоносовский проспект, 31, корп.5;
***
ГНЦРФ, Институт медико-биологических проблем РАН, 123007, Москва, Хорошевское шоссе, 76A
E-mail: olyat@mail.ru Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Исследована возрастная динамика активности сопряженных с а^адренорецепторами сигнальных каскадов в сосудистой гладкой мышце и ее зависимость от созревания симпатической иннервации. Для этого определяли влияние ингибиторов протеинкиназы C (GF109203X, 10" М) и Rho-киназы (Y27632, 10- М) на изометрическое сокращение подкожной артерии крысы в ответ на агонист ai-адренорецепторов - метоксамин. Показано, что у крыс в двухнедельном возрасте (с неполным развитием симпатической иннервации) чувствительность сосудов к метоксамину ниже, чем у взрослых, но действие обоих ингибиторов проявляется сильнее. После удаления симпатических ганглиев у взрослых крыс чувствительность сосудов к мето-ксамину увеличена, но влияние ингибиторов на сокращение в контроле и при денервации не различается. Таким образом, постнатальное развитие гладкой мышцы сосудов сопровождается снижением роли протеинкиназы C и Rho-киназы в регуляции сокращения, но эти изменения не коррелируют с изменениями чувствительности сосудов к ai-адренергической стимуляции и со степенью развитости симпатической иннервации.
Ключевые слова: гладкая мышца, метоксамин, GF109203X, Y27632, постнатальное развитие, денервация.
Сократительные характеристики гладких мышц сосудов изменяются в ходе постнаталь-ного развития [1], однако механизмы этих изменений изучены недостаточно. Известно, что дифференцировка гладкой мышцы в значительной степени регулируется за счет трофического воздействия симпатических нервов на экспрессию специфических белков и, следовательно, регуляторные механизмы сокращения [2,3]. Симпатическая иннервация кровеносных сосудов у многих млекопитающих формируется в раннем постнатальном периоде [4], что совпадает во времени с созреванием гладкой мышцы. Сходная динамика двух процессов позволяет предполагать, что возрастные изменения сокра-
Сокращения: а^ -АР - а1-адренорецепторы, [Са2+] - концентрация свободного Са2+ в цитоплазме; ПКС - проте-инкиназа С; ЯЪоК - ЯЪо-киназа (киназа, активируемая белком ЯЪо), ЛЦМ - легкие цепи миозина, МАРК -митоген-активируемые протеинкиназы.
тимости сосудов могут быть связаны с развитием симпатической иннервации сосудов.
Главным медиатором постганглионарных симпатических волокон является норадреналин, его вазомоторное действие на сосуды связано в основном с активацией а^адренорецепторов (а1-АР) [5]. Долговременные трофические эффекты норадреналина также опосредуются а^ АР [6]. Однако экспрессия мРНК, количество и аффинность а1-адренорецепторов в гладко-мышечных клетках сосудов не зависят от состояния симпатической иннервации [7-9-]. Это означает, что трофическое влияние симпатических нервов реализуется на пострецепторных этапах регуляции сокращения.
Основные сигнальные пути, сопряженные с а^адренорецепторами, включают активацию тримерных ГТФ-связывающих белков О^ц и 012/13. Сигнализация через О^ц ведет к активации фосфолипазы С и образованию инози-
Масса тела, внутренний диаметр, максимальная сила сокращения в ответ на метокеамин и чувствительность подкожной артерии к метоксамину у крыс разных экспериментальных групп
Группы крыс Масса тела, г Диаметр, мкм Максимальная сила сокращения, мН -lg£C50 для метоксамина
Двухнедельные (n = 14) 34 ± 2* 262 ± 10* 9,3 ± 0,7* 5,27 ± 0,06*
Взрослые (n = 10) 338 ± 12 532 ± 13 29,3 ± 2,5 5,66 ± 0,08
Ложнооперирован-ные (n = 12) 398 ± 15 518 ± 31 25,9 ± 3,1 5,81 ± 0,04
Денервация (n = 12) 403 ± 13 530 ± 31 28,9 ± 2,6 6,11 ± 0,05**
Примечание. Приведены значения диаметра при оптимальном растяжении (вычислены, исходя их предположения, что исследуемый сегмент сосуда имеет округлое сечение). Поскольку от каждой крысы получали два препарата, размер выборки для массы тела в два раза меньше, чем для остальных параметров; * - p < 0,05 по сравнению со взрослыми; ** - p < 0,05 по сравнению с ложнооперированными.
толтрифосфата и диацилглицерола, высвобождению Са2+ из внутриклеточных депо и активации протеинкиназы С (ПКС) [5]. Через белки О12/13 сигнал от агадренорецепторов сопряжен с активацией малого О-белка ЯИоА и его мишени - ЯИо-киназы (ЯИоК) [10]. К настоящему времени накоплено много данных о том, что протеинкиназа С и ЯИо-киназа участвуют в регуляции чувствительности сократительного аппарата к ионам Са2+ и, вероятно, гомеостаза Са2+ в гладкомышечных клетках [11-14].
Для некоторых компонентов сигнальных путей, сопряженных с а1-адренорецепторами, были показаны изменения экспрессии или активности в процессе дифференцировки гладкой мышцы [15-19]. Также показано, что активность этих компонентов может различаться в сосудах с разной плотностью иннервации [20] или изменяться после хронической денервации [21,22]. Однако связь между созреванием симпатической иннервации и изменением активности сопряженных с а1-адренорецепторами сигнальных каскадов в развивающейся гладкой мышце сосудов остается неясной.
Целью данной работы было исследовать вклад протеинкиназы С и ЯИо-киназы в регуляцию индуцированного агонистом агАР сокращения подкожной артерии крысы в зависимости от состояния симпатической иннервации. Работу проводили с использованием двух экспериментальных моделей. Во-первых, исследовали вклад этих протеинкиназ в сосудах крыс разного возраста, с разной степенью развития симпатической нервной системы. Во-вторых, была предпринята попытка обратить возрастные изменения регуляции сокращения путем
хронической денервации этой артерии у взрослых крыс. Мы установили, что при созревании гладкой мышцы сосуда увеличивается ее чувствительность к агонисту а^адренорецепто-ров - метоксамину. При этом активность протеинкиназы C и Rho-киназы снижается, но эти изменения происходят независимо от развития симпатической иннервации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовали четыре группы крыс линии Вистар: в возрасте 12 - 15 дней («двухнедельные»), 2 - 3 месяца («взрослые»), а также взрослых крыс с денервированными сосудами и контрольных к ним (ложнооперированных). Масса тела животных представлена в таблице.
Подкожная артерия (а. saphena) - артерия мышечного типа - расположена в голени и приносит кровь к стопе. У взрослых крыс эта артерия густо иннервирована симпатическими волокнами [4,23]. Для денервации подкожной артерии за три недели до эксперимента у наркотизированных нембуталом (40 мг/кг, внутри-брюшинно) крыс удаляли симпатические ганглии (L1-L6) [24]. Мы показали, что такая операция приводит практически к полной и необратимой денервации подкожной артерии (данные не представлены). В день эксперимента крыс декапитировали гильотиной и выделяли подкожную артерию.
Окрашивание адренергичееких нервных волокон. Сегмент артерии (длиной 10 - 12 мм) помещали в 0,1 М фосфатно-солевой раствор (рН 7,2) с добавлением глиоксиловой кислоты (2%), сахарозы (10%) и понтамина небесно-го-
лубого (0,03%). После 30-минутной инкубации препарат расправляли на предметном стекле, высушивали (30 мин под струей теплого воздуха, 5 мин при 100°C), заливали вазелиновым маслом и накрывали покровным стеклом. Использовали микроскоп ЛЮМАМ P3 (ЛОМО, CCCP; объектив х20). Длина волны возбуждающего света составляла 380 - 440 нм, исследуемой люминесценции - 480 - 700 нм.
Эксперименты на изолированных сосудах. Кольцевые сегменты артерии длиной 2 мм закрепляли в двухканальном миографе для регистрации сокращения в изометрическом режиме (Danish Myo Tedinology A/S, Дания). Для взрослых крыс использовали два соседних сегмента одной артерии, для двухнедельных - сегменты артерий из двух задних конечностей. После прогрева миографа до 37°C определяли растяжение препарата, оптимальное для проявления сократительной активности [25]. Использовали раствор следующего состава (мМ): NaCl - 120; NaHCO3 - 26; KCl - 4,5; CaCl2 - 1,6; MgSO4
- 1,0; NaH2PO4 - 1,2; D-глюкоза - 5,5; ЭДТА
- 0,025; HEPES - 5,0. Его непрерывно аэрировали карбогеном (5% CO2 + 95% O2) для поддержания рН 7,4. Препараты активировали двукратным добавлением норадреналина (10-5 М, длительность каждого сокращения - 5 мин, интервал - 10 мин).
Исследовали сокращение препаратов в ответ на метоксамин и его изменения под действием ингибиторов Rho-киназы (Y27632, 10-5 М) и протеинкиназы C (GF109203X, 10-6 М).
Метоксамин, в отличие от норадреналина, не подвергается обратному захвату в нервные терминали, что позволяет адекватно сопоставлять реакции сосудов с разной плотностью иннервации. Pеакции на метоксамин исследовали кумулятивно, действие каждой концентрации длилось 3-5 мин до стабилизации силы сокращения. При использовании метоксамина или других агонистов а^адренорецепторов эксперименты можно проводить на препаратах с интактным эндотелием, поскольку а1-адреноре-цепторы расположены только в гладкомышеч-ных клетках и отсутствуют в эндотелии [5].
После регистрации первой зависимости «концентрация-эффект» к препарату в одном из каналов миографа добавляли Y27632, а к другому препарату - GF109203X. После 15-минутной инкубации повторно тестировали реакции на метоксамин. Все использовавшиеся фармакологические препараты были фирмы Sigma (CmA).
Регистрация и обработка данных. Pегиcтpа-цию силы сокращения проводили на компью-
тере c помощью аналого-цифрового преобразователя (частота оцифровки 0,5 Гц) и программы Myodag 2.02(Danish Myo Technology A/S).
Значения силы сокращения при действии разных концентраций метоксамина аппроксимировали уравнением: EA = Emax х
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.