ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 533-540
УДК 547.9:581.19
ВКЛАД РАЗЛИЧНЫХ ИЗОФЕРМЕНТОВ а-АМИЛАЗЫ ТОВАРНОГО ЗЕРНА ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ В ФОРМИРОВАНИЕ ВЕЛИЧИНЫ ЧИСЛА
ПАДЕНИЯ
© 2014 г. Н. С. Мамытова, В. А. Кузовлев, А. А. Хакимжанов, О. В. Фурсов
Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина, Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, 050012, г. Алматы
e-mail: mamytovanur@gmail.com Поступила в редакцию 25.10.2013 г.
Изучено участие различных изоферментов а-амилазы в формировании показателя числа падения товарного продовольственного зерна пшеницы, выращенной в Республике Казахстан. Установлено, что в зерне с этим показателем более 200 с присутствовали активные изоферменты а-AMYl и a-AMY2 зародышевого щитка. Значительное снижение числа падения зависело в основном от синтеза изоферментов a-AMY1 и a-AMY2 в алейроновом слое. В зерне, обнаружены изоферменты с высокими изоэлектрическими точками (pI > 7.3), относящиеся к a-амилазе позднего созревания или практически зрелого зерна. Обнаружено, что экзогенный гормон (гибберелловая кислота) индуцировал синтез изоферментов a-амилазы щитка и целой зерновки, а также алейрона. При этом оказалось, что в зерне с низким значением числа падения снижалось воздействие экзогенной гиббереловой кислоты как на активность, так и состав a-амилаз.
DOI: 10.7868/S0555109914040242
Предуборочное прорастание (pre-harvest sprouting, PHS) — один из важных факторов, влияющих на качество урожая пшеницы во всех зернопроиз-водящих регионах, особенно при высокой влажности в период созревания [1]. Выведение устойчивых к PHS генотипов пшеницы имеет огромное значение для повышения качества зерна и его производства.
Предуборочное прорастание определяется как условиями внешней среды, так и внутренними факторами, а также взаимодействием этих условий и факторов [2]. В ряде климатических зон Республики Казахстан резкие изменения погоды в период созревания вызывают прорастание в колосе, что приводит к значительному ухудшению хлебопекарных свойств зерна и часто к полной непригодности его для хлебопекарной промышленности [3]. PHS связано с избыточным синтезом определенных форм а-амилазы (1,4-глюкан-4-глюкогидро-лаза, КФ3.2.1.1), которые гидролизуют крахмал эндосперма, вследствие чего наблюдается сыропек-лость хлеба, липкость мякиша, изменение цвета идр. [4].
Одним из условий надежной идентификации зерна, т.е. разделения фенотипов пшеницы на устойчивые и неустойчивые к PHS, является подбор надежных биохимических маркеров. При фе-нотипировании следует учитывать, что такие показатели как число падения и активность а-амилазы отражают не столько собственно PHS, сколько изменения свойств крахмала эндосперма, однако
надежно коррелируют с показателем устойчивости [3—5]. К наилучшему методу определения степени дефектности муки c примесью проросшего зерна можно отнести тот, результаты которого корреллируют с основным показателем качества хлеба, т.е. со степенью отклонения свойств мякиша от его нормального состояния. В мире за основной метод определения дефектности зерна принят метод определения числа падения (ЧП) [6]. Величина этого показателя хорошо коррелирует с относительной упругостью мякиша хлеба и содержанием в нем водорастворимых веществ. Между величиной ЧП и активностью а-амилазы наблюдается высокая корреляция [5].
Установлена генетическая природа устойчивости семян пшеницы к прорастанию на корню [7]. Эта устойчивость обусловлена, с одной стороны, влиянием Vp-1 генов, контролирующих покой семян, с другой — действием ряда иных механизмов и экспрессией других генов [8].
Одной из причин неустойчивости созревающих семян к PHS может быть не отсутствие генов/локу-сов устойчивости к прорастанию на корню, а наличие "дефектных генов", которые ответственны за синтез определенных форм а-амилазы на поздних стадиях развития зерновки, без проявления видимых признаков прорастания. Это явление известно как "появление" а-амилазы в практически зрелом зерне (pre-maturity а-amylase activity, РМАА) или синтез а-амилазы "позднего созревания" (late maturity а-amylase, LMA) [8—10]. Оно сопровож-
дается снижением ЧП и ухудшением хлебопекарных свойств зерна и индуцируется внешним температурным шоком (холод и жара) на 25—30 сут после цветения [7].
В регуляции покоя и прорастания участвуют два основных гормона — абцизовая (АБК) и гиббере-ловая (ГК3) кислоты. Количество АБК и ГК3 и их баланс в зерновке — важнейшие факторы контроля развития, созревания и прорастания семян, стимуляции и подавления синтеза а-амилазы [10].
Обнаружены сорта сорго (Sorghum bicolor L.), в семенах которых при экзогенном внесении гормона ГК3 повышался синтез а-амилазы, а также сорта, в семенах которых при добавлении АБК наблюдалась репрессия синтеза фермента [11]. В наших исследованиях было установлено, что устойчивый к прорастанию в колосе сорт пшеницы Лютесценс 70, обладал большим содержанием АБК в зерновке по сравнению с неустойчивым сортом — Новосибирская 67 [12].
Были созданы генно-модифицированные растения пшеницы с повышенной устойчивостью к предуборочному прорастанию. Сверхэкспрессия генаAbVp-1, гомолога Vp-1 из дикого овса, в трансгенной пшенице увеличивала устойчивость к прорастанию зерна в колосе при действии АБК и снижала эффект PHS на 50% [13]. Другое направление придания пшенице повышенной устойчивости к PHS включает "утилизацию" избыточного гормона ГК3, которая достигалась в пшенице сверхэкспрессией ГК3 2-оксидазного гена бобовых [14].
Помимо различных способов подавления активности а-амилазы гормонами, устойчивость к PHS может зависеть от содержания белкового ингибитора а-амилазы/субтилизина (а-amylase/sub-tilisin inhibitor, ASI), который в семенах пшеницы, ячменя, ржи ингибирует активность а-амилазы и прорастание семени [15, 16].
Идентифицированы три группы изофермен-тов а-амилазы, способствующие проявлению PHS семян пшеницы. К ним относятся "солодовая" а-амилаза (a-AMY1), синтез которой контролируется гомологичными хромосомами группы 6, "зеленая" — а-амилаза (a-AMY2), синтез которой контролируется хромосомой 7-й группы, и ферментом перикарпия (a-AMY3) [17]. Уровень экспрессии а-ЛМУ1 и а-ЛМУ2 регулируется гиббе-релловой кислотой [18]. Термолабильные изофер-менты а-ЛМУ3 также негативно влияют на качество зерна и хлебопекарных продуктов [19].
Таким образом, устойчивость зерна к PHS имеет генетическую природу и зависит от целого ряда условий: соотношения гормонов ГК3 и АБК, наличия дефектных генов (LMA), окраски зерновки, длины стебля и, естественно, от степени проявления активности различных изоферментов а-амилазы. Известно, что каждая из генетически детер-
минированных групп a-амилаз вносит различный вклад в общую активность фермента. Величина показателя ЧП определяется в результате действия всех изоферментов a-амилазы. Определение параметра ЧП и степени участия различных изофер-ментов позволяет выяснить группу ферментов, от которой прежде всего зависит дефектность зерна вследствие PHS.
Цель работы — определить роль изоферментов a-амилазы в формировании ЧП различных партий товарного зерна яровой пшеницы.
МЕТОДИКА
В работе использованы партии товарного зерна яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) урожая 2012 г. с различными значениями ЧП, выращенного в северных районах Республики Казахстан. Пробы зерна для определения ЧП, активности a-амилаз и изоэлектрофокусирования (ИЭФ) отбирали согласно требованиям международного стандарта, ИСО (Международная организация стандартизации) 3093-2009[20].
Зерно в количестве не менее 300 г размалывали на лабораторной мельнице 3100 ("Perten Instruments", Швеция). Исследовали также половинки зерна без зародыша, которые размалывали на той же мельнице. Однако ЧП определяли только для помола целого зерна (шрот).
Зародыши со щитками получали следующим способом. Семена обрабатывали 5%-ным перок-сидом водорода в течение 20 мин, затем промывали несколькими порциями дистиллированной воды и высевали в чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой. Из наклюнувшихся семян после 24 ч выращивания в асептических условиях отбирали зародыши с целыми неповрежденными щитками.
Беззародышевые половинки зерна (алейроновый слой) и изолированные зародыши инкубировали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге в присутствии 1 мкМ ГК3 ("Sigma", США) и без гормона в течение 72 ч при 20°С [21]. ЧП шрота определяли на приборе Falling Number 1700 ("Perten Instruments", Швеция) согласно стандарту ИСО [20].
Активность a-амилазы определяли крахмал-йодным методом, описанным в работе [22], и выражали в единицах активности на мл/ч. ИЭФ a-амилаз проводили в пластинах 5%-ного ПААГ толщиной 1мм в градиенте pH 4.0—9.0, создаваемого амфолитами ("Sigma", США). По окончании ИЭФ гели инкубировали в 1.5%-ном растворе крахмала в течение 1 ч при 4° С с последующим выявлением зон активного фермента раствором J2/KJ. Для определения изоэлектрических точек (ИЭТ) изоферментов a-амилазы использовали белки-маркеры фирмы "Serva" (Германия).
Эксперименты и измерения ферментативной активности проводились в трех повторностях. Данные представлены средними арифметическими значениями и их стандартными отклонениями.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовано изменение показателя ЧП шрота товарного зерна пшеницы с различным уровнем активности а-амилазы. На рис. 1 видно, что существует четкая зависимость ЧП от содержания а-амилазы семян. С увеличением в них а-ами-лазной активности ЧП снижалось.
Для различных сортов пщеницы ранее было показано, что каждая из форм а-амилазы в определенной степени влияет на значение ЧП созревающего зерна [9]. Однако до настоящего времени не изучалась роль отдельных групп ферментов и их состава в формировании величины ЧП товарного зерна пшеницы.
На рис. 2 представлены результаты изменения активности а-амилаз и их изоферментный состав в помоле целых семян (шрот) и их беззародышевых половинках из товарного зерна пшеницы с различными значениями ЧП. Данные диаграммы, приведенной на рис. 2а, позволили предположить, что снижение ЧП связано как с синтезом а-амилаз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.