УДК 577.112.043
По материалам доклада на VI Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (11-15 VI, 2013)
ВКЛЮЧЕНИЕ БЕЛКОВ В ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ МЕТОДАМИ КОПРЕЦИПИТАЦИИ И АДСОРБЦИИ
© 2013 г. О. Ю. Кочеткова*, **, #, Л. И. Казакова*, Д. А. Мошков*, М. Г. Винокуров**, Л. И. Шабарчина*
*ФГБУНИнститут теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3
**ФГБУН Институт биофизики клетки РАН, 142290, Московская обл., Пущино, ул. Институтская, 3 Поступила в редакцию 29.03.2013 г. Принята к печати 22.04.2013 г.
Получены микрокапсулы, сформированные из синтетических (полистиролсульфонат натрия и полиалилламин гидрохлорид) и биодеградируемых (декстрансульфат и полиаргинин гидрохлорид) полиэлектролитов на карбонатных микрочастицах. Методом просвечивающей электронной микроскопии исследована ультраструктурная организация биодеградируемых микрокапсул. Оболочка биодеградируемых микрокапсул хорошо сформирована уже при шести полиэлектролитных слоях со средней толщиной 44 ± 3.0 нм, а их внутренний полиэлектролитный матрикс более разряжен, чем у синтетических микрокапсул. С помощью метода спектроскопии оценена эффективность включения Б1ТС-меченного БСА методом адсорбции в синтетические микрокапсулы в зависимости от числа полиэлектролитных слоев в них. Показано, что максимальное количество белка включалось в капсулы, имеющие 6 и 7 полиэлектролитных слоев (4 и 2 пг/капсулу соответственно). Сделан вывод, что адсорбция белков в готовые полиэлектролитные капсулы позволяет избежать потери белка по сравнению с методом, в котором для капсулирования используют биоминеральные ядра, получаемые методом копреципитации
Ключевые слова: полиэлектролитные микрокапсулы, полиэлектролиты, копреципитация, адсорбция, электронная микроскопия, инкапсулирование.
БО1: 10.7868/80132342313050084
ВВЕДЕНИЕ
С начала появления первых работ, посвященных получению полиэлектролитных микрокапсул (1998 г.), по сей день остаются актуальными исследования, направленные на изучение их структуры и физико-химических свойств [1—3]. Полиэлектролитные микрокапсулы (ПЭМК) получают путем поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на заряженные каркасные коллоидные частицы нано- и
Сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин; ИП-ЭК — интерполиэлектролитный комплекс; ПЭ — полиэлектролиты; ПЭМК — полиэлектролитные микрокапсулы;
декстрансульфат; БОТА — этилендиаминтетрауксусная кислота; ИТС — флуоресцеинизотиоционат; РАг — полиаргинин гидрохлорид; РАН — полиаллиламин гидрохлорид; Р88 — полистиролсульфонат натрия, #Автор для связи (тел.: +7 (4967) 73-92-05; эл. почта: o.y.kochetkova@gmail.com).
микроразмеров (ядра) с последующим удалением каркасных частиц [4—6]. В зависимости от морфологии и состава микрочастиц, используемых в качестве каркаса (матрицы) для нанесения полиэлектролитных слоев, результатом могут являться полые полиэлектролитные микрокапсулы, или микрокапсулы матриксного типа, заполненные пространственно сложно организованным полиэлектролитным комплексом, повторяющим внутреннюю структуру каркасных частиц [6, 7].
Многообразие вариантов дизайна полиэлектролитных капсул предоставляет возможность их широкого прикладного применения [8—10]. В зависимости от планируемой цели использования микрокапсул их оболочка может быть сформирована из синтетических полиэлектролитов (ПЭ): недеградируемых (полиаллиламин гидрохлорид, полистиролсульфонат натрия, полидиаллилди-метиламмонийхлорид — далее синтетические)
или биодеградируемых (декстрансульфат, альги-нат натрия, полиаргинин гидрохлорид и других). Сформированные из биополимеров капсулы используют в системе доставки биологически активных компонентов к клеткам и тканям, для создания пролонгированных лекарственных средств [11—15]. Наибольшее число публикаций в этой области относится к капсулированию высокомолекулярных веществ, в частности белков [16—18]. В литературе описано несколько способов успешного включения белков в ПЭМК [19—21].
Наиболее популярным стал метод получения белоксодержащих полиэлектролитных микрокапсул, основанный на использовании биоминеральных ядер в качестве матрицы для адсорбции полиэлектролитных слоев [22, 23]. Биоминеральные ядра представляют собой коллоидные частицы, обычно микронного размера, которые являются продуктами копреципитации белков с солями щелочноземельных металлов, в большинстве случаев с карбонатом кальция [22—24]. После формирования на таких частицах полиэлектролитной оболочки и растворения минеральной основы (подкисле-ние среды, растворение в БЭТА) получают полиэлектролитные капсулы с содержанием белка до 10 пг на микрокапсулу [6, 16, 25, 26].
Наряду с методом копреципитации описано включение биоактивных веществ в уже готовые полиэлектролитные микрокапсулы методом адсорбции [6, 16, 26]. В работе Балабушевич и др. описано эффективное включение белков различных молекулярных масс и зарядов в готовые полиэлектролитные микрокапсулы, сформированные с применением меламинформальдегидных ядер. Свойством микрокапсул, позволяющим включение в них белков, авторы считают наличие в полости таких капсул гелеобразной структуры, образующейся в результате растворения ядра [26].
В работе Д.В. Володькина и др. описан процесс адсорбции белков в ПЭМК, сформированных с применением минеральных ядер карбоната кальция [6]. Авторы этой работы объясняют возможность включения в капсулы белков их взаимодействием с заряженными нескомпенсированными участками интерполиэлектролитного комплекса (ИПЭК), образующегося вследствие адсорбции ПЭ в полостях пористых микрочастиц карбоната кальция. Помимо чисто логических заключений о роли электростатических взаимодействий в этом процессе, в качестве доказательства существования таких фрагментов авторы приводят данные рентгеноструктурного анализа, показывающие в структуре капсул, сформированных из синтетических полиэлектролитов Р88 и РАН, свободные заряженные функциональные группы полисти-ролсульфоната. Прямых инструментальных методов, позволяющих оценить количество свобод-
ных заряженных групп ПЭ в составе комплексов, пока не существует.
Наглядное представление о процессе адсорбции белков в ПЭМК, характере распределения белковых молекул в капсулах и потенциальном их количестве, по нашему мнению, может дать анализ внутренней ультраструктурной организации ПЭМК. Ранее с применением метода просвечивающей электронной микроскопии нами был проведен анализ ультратонких срезов ПЭМК, сформированных на пористых минеральных частицах СаС03 с использованием синтетических полиэлектролитов — РАН и Р88 [6]. Было показано, что последовательное осуществление стадий адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов в процессе получения ПЭМК, приводит сначала к формированию разветвленного внутреннего полиэлектролитного матрикса, а затем, по мере заполнения полимерами полостей СаС03-микрочастицы, — к формированию полиэлектролитных слоев оболочки капсулы. Для капсул размерами 4.5—5 мкм, полученных из названной пары полиэлектролитов, было отмечено образование однородной хорошо сформированной оболочки из 9 полиэлектролитных слоев. Такое же число полиэлектролитных слоев позволяет надежно удерживать белки внутри капсул в случае, когда в качестве матрицы для нанесения полиэлектролитов используются биоминеральные частицы [6, 7].
В связи с этим представляется интересным установить связь между числом полиэлектролитных слоев оболочки капсул и количеством белка, которое можно включить в микрокапсулы методом адсорбции. Эти данные позволят исключить потери белка на стадии его инкапсулирования. Также, в отличие от метода инкапсулирования, предполагающего использование копреципита-тов, метод, основанный на адсорбции, позволит включать в ПЭМК строго определенные малые количества веществ. Поэтому определение архитектуры полиэлектролитных капсул, оптимальной для инкапсулирования белков методом адсорбции, является одной из основных целей данного исследования. Понимание этого вопроса особенно важно при капсулировании регуляторных белков и пептидов, обладающих высокой биологической активностью и, зачастую, очень высокой ценой. В настоящей работе поставленные задачи решались с использованием модельного белка — флуоресцентно-меченного бычьего сывороточного альбумина, включение которого в капсулы контролировали спектрофотометрически.
В свете возможности дальнейшего практического применения метода адсорбции для инкапсулирования биологически активных веществ и использования таких капсул в биомедицине и фармацевтике, представляется целесообразным
Рис. 1. Электронные микрофотографии ультратонких срезов полиэлектролитных микрокапсул, сформированных на карбонатных ядрах: из синтетических полиэлектролитов, с архитектурой (РАИ/Р88)3 (а); и биодеградируемых, имеющих архитектуру (Э8/РАт)3 (б).
изучить включение белков в ПЭМК, сформированные из природных биополимеров. Ультраструктура биодеградируемых капсул, сформированных из декстрансульфата и полиаргинин гидрохлорида, была установлена с помощью метода просвечивающей электронной микроскопии. Для адсорбции использовали электронно-плотный белок ферритин, позволяющий без дополнительного контрастирования срезов капсул выявить локализацию белка в капсулах после адсорбции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С помощью метода просвечивающей электронной микроскопии были получены изображения срезов полиэлектролитных микрокапсул, сформированных на микрочастицах СаСО3 с применением биодеградируемых полиэлектролитов DS и PAr, и проведен их сравнительный анализ с капсулами, сформированными на таких же карбонатных ядрах из синтетических полиэлектролитов PSS и PAH (рис. 1). Оба типа капсул контрастировали с помощью водного раствора уранилацетата и цитрата свинца для визуализации полиэлектролитной оболочки. Микрокапсулы, сформированные на СаСО3-микрочастицах из синтетических полиэлектролитов PSS и PAH, внешней регулярной оболочкой не обладали и состояли из набора нитевидных линейных и замкнутых наноразмерных элементов. Внутренняя структура таких капсул представляла собой сложно организованный матрикс в виде "гу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.