ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 517-525
УДК 581.2:58.071
ВЛИЯНИЕ 1-МЕТИЛЦИКЛОПРОПЕНА НА КОМПОНЕНТЫ ПРО-/АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ И РАЗВИТИЕ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ ПРИ ГРИБНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ
© 2014 г. С. В. Веселова, Т. В. Нужная, И. В. Максимов
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа 450054 e-mail: veselova75@rambler.ru Поступила в редакцию 27.12.2013 г.
Изучено влияние 1-метилциклопропена (1-МЦП), ингибирующего рецепцию этилена, на генерацию пероксида водорода, активность оксалатоксидазы, пероксидазы, каталазы и отложение лигнина в инфицированных листьях мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов, контрастных по устойчивости к возбудителю септориоза Septoria nodorum Berk. Снижение степени развития сеп-ториоза на листьях пшеницы под влиянием 1-МЦП, сопровождалось, с одной стороны, подавлением активности каталазы, а с другой повышением активности оксалатоксидазы, пероксидазы, накоплением Н2О2 в тканях и интенсивным отложением лигнина в зоне инфицирования. Обсуждается роль системы рецепции этилена в защитном ответе растений на инфицирование гемибиотрофным патогеном, возбудителем септориоза.
DOI: 10.7868/S0555109914050134
Важными компонентами защитной системы растений являются прооксидантные и антиокси-дантные ферменты, ответственные за быструю генерацию и утилизацию активных форм кислорода (АФК), которые вовлечены в индуцирование программированной гибели клеток, ограничение роста патогена и передачу сигнала в качестве вторичных посредников [1—4]. Про-/антиоксидант-ный статус растений находится под строгим контролем гормонов, участвующих в формировании защитных реакций при стрессе [4—6].
Среди них этилен активно участвует в таких физиологических процессах развития растений, как прорастание семян, рост клеток растяжением, образование адвентивных корней и корневых волосков, гравитропизм, формирование вегетативных и генеративных органов, эмбриогенез, созревание плодов, старение, опадение листьев и плодов [7—10]. Кроме того, он участвует в системе запуска и регуляции защитных реакций растений на различные стрессовые воздействия, в том числе биотические [7, 8, 10]. Так, совместно с жасмо-новой кислотой этилен формирует индуцированную системную устойчивость, направленную на защиту растений от некротрофов и фитофагов [8].
В литературе много противоречивых данных о механизмах регуляции этилен-зависимых защитных ответов растений при патогенезе [6, 11—13, 16]. Практически все работы о роли этилена в защитных механизмах растений при поражении патогенами включают изучение арабидопсиса в качестве модельного растения [8—10]. Однако недостаточно изучен этиленовый сигнальный путь у
однодольных растений [6, 14]. Поэтому особый интерес представляет понимание роли этиленовой сигнальной системы в регуляции про-/анти-оксидантного статуса однодольных растений при патогенезе [6, 16, 17].
Известно, что необратимое связывание этилена с рецепторами и дальнейшая передача сигнала ин-гибируются 1-метилциклопропеном (1-МЦП) [18], который нашел широкое применение при хранении фруктов для задержки их созревания. Однако его роль в защите растения от патогенов крайне противоречива, поскольку 1-МЦП может индуцировать в них как устойчивость, так и восприимчивость к патогенам [19, 20].
Цель работы — изучение влияния рецепции этилена на формирование защитных реакций растений мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) двух сортов, контрастных по устойчивости к возбудителю септориоза Septoria nodorum Berk.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили проростки мягкой яровой пшеницы сортов Казахстанская 10 (Каз10) (восприимчивый) и Омская 35 (Ом35) (устойчивый), контрастных по устойчивости к S. nodorum Berk. Семена после стерилизации 80%-ным этанолом и промывки стерильной водой проращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге. Проростки переносили в сосуды с 10%-ным раствором питательной среды Хоглан-да-Арнона и помещали в климатостат КС-200 СПУ (Россия). Условия выращивания: температура
20/24°С (ночь/день), 16 ч светопериод, освещенность 10 тыс. люкс (лампы Osram L 36W/77). После 7 сут роста полностью развернутые первые листья срезали и помещали в чашки Петри на влажную вату с добавлением бензимидазола (40 мг/л) [21]. Через 5—6 ч после адаптационного периода часть листьев обрабатывали раствором (0.1 г/л) 1-МЦП ("AgroFresh Inc, Spring House PA", США), немедленно закрывали и помещали в темноту [22]. Через 24 ч листья инфицировали суспензией пик-носпор агрессивного штамма гриба S. nodorum (105 спор/мл) из коллекции лаборатории и переносили в климатостат КС-200 СПУ.
Развитие симптомов септориоза на листьях пшеницы, наблюдаемые в течение 9 сут, фиксировали с помощью Olympus SP-800UZ Image Stabilization (Индонезия). Площадь зоны поражения измеряли с помощью компьютерной программы ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/download.html).
Растительный материал (1 : 5 вес/об.) гомогенизировали в 0.05 М Na-фосфатном буфере (ФБ), рН 6.2, и инкубировали при 4°С в течение 30 мин. Супернатант отделяли центрифугированием при 15000 g (5415К "Eppendorf", США).
Концентрацию пероксида водорода определяли по методу [23], используя ксиленол оранжевый в присутствии Fe2+. Затем смесь центрифугировали 10 мин при 8000 g. Оптическую плотность комплекса измеряли при 560 нм на спектрофотометре BioSpec-Mini ("Shimadzu", Япония).
Активность пероксидазы (КФ 1.11.1.7) (ПО) определяли по модифицированному методу [24]. В лунки планшета ("Nunc", США) добавляли 75 мкл супернатанта в 0.05 М ФБ (1 : 30 об./об.), 25 мкл 0.05%-ного раствора (о-)-фенилендиамина (ОФД) и 25 мкл 0.0016%-ного раствора Н2О2. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 4 н H2SO4.
Активность оксалатоксидазы (КФ 1.2.3.4, ОО) определяли по методу [25]. Оптическую плотность измеряли при 490 нм на спектрофотометре Benchmark Microplate Reader ("Bio Rad", США). Активности ферментов выражали в оптических ед./мг белка.
Содержание белка определяли по методу Бредфорд.
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6, КАТ) определяли по методу [26], основанному на способности Н2О2 образовывать с солями молибдата стойкий окрашенный комплекс. В лунки планшета ("Nunc", США) к 150 мкл 0.03%-ного раствора Н2О2 добавляли 20 мкл растительного экстракта. Контрольная проба содержала 150 мкл воды. Реакцию останавливали добавлением 75 мкл 4%-ного раствора молибдата аммония. Оптическую плотность измеряли при 405 нм. Активность каталазы рассчитывали по формуле: Е = (Ак — Ао)УК, где
Е — активность каталазы, Ак и А — поглощение контрольной и опытной проб соответственно, V — объем вносимой пробы, мл, t — время инкубации, с, К — молярный коэффициент экстинкции Н2О2, равный 22.2 х 103 мМ-1 см-1. Активность каталазы выражали в мкМ Н2О2/мг сырой массы/мин.
Для гистохимических исследований отрезки листьев через 1, 2 и 3 сут после инокуляции фиксировали в 96%-ном этаноле. Поверхность и ткани растений окрашивали 1.0%-ным раствором анилинового синего в 1%-ной молочной кислоте с последующей дифференцировкой окраски в насыщенном растворе хлоралгидрата [27]. В результате структуры гриба окрашивались в сине-фиолетовый цвет.
Автофлуоресценцию лигнина наблюдали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-510 на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200M ("Carl Zeiss", Германия). Для возбуждения автофлуоресценции использовали аргоновый лазер 30 мВт с длиной волны 488 нм, дихроичным зеркалом 490 нм и пропускающем светофильтром 505 нм [28].
Накопление Н2О2 в инфицированных тканях листьев определяли через 24 ч после инокуляции путем витального окрашивания 3,3-диаминобен-зидином (ДАБ) [15]. Высечки листьев помещали в 0.1 М ФБ, pH 6.2, содержащий 1 мг/мл ДАБ, инкубировали в вакууме в течение 30 мин и 6 ч при комнатной температуре. После окрашивания отрезки листьев фиксировали в 96%-ном этаноле и кипятили в течение 10 мин. После кипячения листья помещали в 50%-ный раствор глицерина.
Для регистрации развития инфекционных структур гриба и накопления Н2О2 использовали цифровой микроскоп BZ8100E ("Keyence", Япония).
Эксперименты проводили в 3 биологических и 3 аналитических повторностях. Для статистической обработки результатов использовали компьютерные программы Statistica 6.0 ("StatSoft", Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Развитие симптомов заболевания. Различия в развитии мицелия на поверхности листьев пшеницы разных сортов обнаруживались через 24 ч после инокуляции (рис. 1). У восприимчивого сорта Каз10 зона нанесения суспензии спор была густо покрыта мицелием, тогда как на поверхности листа относительно устойчивого сорта Ом35 мицелий развивался гораздо медленнее. Следовательно, уже на начальных этапах инфицирования наблюдались значительные различия в развитии патогена на листьях растений пшеницы. Так, через 4 сут отмечалась зависимость проявления признаков заболевания от сорта пшеницы и усло-
Рис. 1. Рост мицелия гриба S. nodorum на поверхности листьев пшеницы сортов Казахстанская 10 (а, б) и Омская 35 (в, г) через 24 ч (I) и симптомы септориоза листьев через 9 сут после инфицирования (II): а, в — инфицированные листья, б, г — инфицированные листья после обработки 1-МЦП.
мм 40
35
30
25
20
15 |-
10
5
8 9 сут
Рис. 2. Влияние 1-МЦП на развитие септориоза в листьях растений пшеницы контрастных по устойчивости сортов Казахстанская 10 (1, 3) и Омская 35 (2, 4): 1, 2 — инфицированные листья данных сортов, 3, 4 — инфицированные листья данных сортов после обработки 1-МЦП. Эксперименты проводили в 9 повтор-ностях. Приведены стандартные ошибки.
вий эксперимента (рис. 2). Через 9 сут после заражения на листьях восприимчивого сорта Каз10 наблюдали крупные зоны поражения с пикнида-ми, а на листьях устойчивого сорта Ом35 эти зоны были небольшие и без пикнид (рис. 1, 2). Под влиянием 1-МЦП у обоих сортов задерживался рост мицелия на поверхности листа (рис. 1), что в последующем приводило к заметному замедлению проявления симптомов заболевания и формирования в листьях пикнид патогена (рис. 1, 2).
Накопление Н2О2. Содержание Н2О2 через 24 ч в листьях инфицированных растений пшени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.