ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 4, с. 499-505
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ 24-ЭПИБРАССИНОЛИДА НА РОСТ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ И СОДЕРЖАНИЕ ДЕГИДРИНОВ В УСЛОВИЯХ КАДМИЕВОГО СТРЕССА
© 2015 г. Ч. Р. Аллагулова, Д. Р. Масленникова, А. М. Авальбаев, К. А. Федорова,
Р. А. Юлдашев, Ф. М. Шакирова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа Поступила в редакцию 21.11.2014 г.
Исследовали влияние предобработки 0.4 мкМ 24-эпибрассинолидом (ЭБ) на устойчивость 4-суточ-ных проростков пшеницы (Тпйсит авзйуыт Ь.) к последующему действию 1 мМ ацетата кадмия. Предобработка ЭБ снижала степень повреждающего действия кадмия на растения пшеницы, о чем судили по уменьшению уровня стресс-индуцированного экзоосмоса электролитов и способности к поддержанию ростовых параметров на уровне, близком к контролю. Важный вклад в развитие пре-дадаптирующего и защитного эффектов ЭБ на проростки пшеницы вносит его способность индуцировать двукратное накопление дегидрина с мол. м. 28 кД в нормальных условиях произрастания и вызывать дополнительное накопление этого белка при воздействии ацетата кадмия. С помощью ингибитора биосинтеза АБК флуридона выявлены, как зависимые, так и независимые от эндогенной АБК, пути регуляции уровня дегидрина 28 кД в предобработанных и необработанных ЭБ растениях пшеницы в условиях кадмиевого стресса.
Ключевые слова: Тпйсит ав5иуыт — дегидрины — 24-эпибрассинолид — АБК — флуридон — ацетат кадмия — абиотический стресс — устойчивость
БО1: 10.7868/80015330315040028
ВВЕДЕНИЕ
В связи с ростом техногенного загрязнения почв особую остроту приобретает проблема воздействия избыточных концентраций солей тяжелых металлов (ТМ) на растения, что приводит к торможению их роста и развития, потере урожая и его качества. Среди ТМ особую опасность представляет кадмий, поскольку он не является необходимым элементом для жизнедеятельности растений, но, обладая высокой биодоступностью, легко проникает в ткани, нарушая протекание всех звеньев метаболизма. К характерным ответным реакциям растений на присутствие кадмия в среде можно отнести быстрое накопление АБК, играющей ключевую роль в регуляции закрытия устьиц, снижая транспирацию, поглощение и транспорт воды, что способствует торможению поступления кадмия в растения [1, 2]. Это в свою очередь приводит к обезвоживанию, что сопровождается запуском АБК-контролируемых защитных реакций,
Сокращения: БС — брассиностероиды; МИ — митотический индекс; ТМ — тяжелые металлы; Фл — флуридон; ЭБ — 24-эпибрассинолид.
Адрес для корреспонденции: Шакирова Фарида Минниханов-на. 450054 Уфа, пр. Октября, 71. Институт биохимии и генетики УНЦ РАН. Электронная почта: shakirova@anrb.ru
в спектре которых важное место отводится белкам дегидринам [3—5]. Обладая свойствами шаперо-нов, эти белки вовлекаются в защиту клеточных структур от вызываемых обезвоживанием повреждений [5—7]. Кроме того, имеются убедительные данные об участии дегидринов в связывании и де-токсикации ионов ТМ, а также в нейтрализации генерируемых ТМ активных форм кислорода (АФК) [8, 9].
Наряду с АБК в защиту растений от ТМ вовлекаются и другие фитогормоны, в частности, брассиностероиды (БС), которые сочетают в себе свойства стимуляторов роста и индукторов защитных реакций, направленных на снижение повреждающего действия на растительный организм разных по природе стрессовых факторов, включая ТМ [10—12]. Благодаря тому, что БС проявляют широкий спектр физиологического действия в крайне низких концентрациях, они весьма привлекательны для практического использования с целью увеличения стресс-устойчивости и продуктивности разных культурных растений [11, 13, 14]. Так, имеются сведения о том, что проявление защитного эффекта 24-эпибрассинолида (ЭБ) и 28-гомобрас-синолида на рост растений пшеницы в условиях кадмиевого стресса связано с нейтрализацией ин-
дуцируемого токсическими ионами повреждения фотосинтетического аппарата [15]. Кроме того, показано, что обработка томата ЭБ тормозит проникновение кадмия в растения и способствует повышению урожая и его качества [16, 17]. В связи с этим особый интерес вызывает исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе индуцированной БС устойчивости растений к токсическому действию кадмия.
Основываясь на данных об активации транскрипции клонированного нами гена ТАБНЫ де-гидрина в проростках пшеницы в ответ на кадмиевый стресс [18], а также накоплении в растениях пшеницы транскриптов этого гена в ответ на обработку ЭБ в нормальных условиях произрастания при отсутствии изменений в уровне эндогенной АБК [19], можно было ожидать вовлечения белков дегидринов в реализацию предадаптирую-щего и протекторного действия ЭБ на растения к воздействию кадмия.
Цель работы заключалась в выявлении участия дегидринов в проявлении защитного действия ЭБ на проростки пшеницы, подвергнутые воздействию ацетата кадмия, и оценке роли эндогенной АБК в этом процессе. С помощью ингибиторного анализа в растениях пшеницы были выявлены как зависимые, так и независимые от эндогенной АБК пути регуляции уровня дегидрина с мол. м. 28 кД, вовлекаемого в проявление защитного эффекта ЭБ в условиях кадмиевого стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили проростки пшеницы (ТгШеыш агзИуыт Ь.) сорта Башкирская 26. Семена после стерилизации 96% этанолом проращивали в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водой при 21—23°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 клк. После отделения эндосперма часть 3-суточных проростков помещали на 24 ч на раствор 2% сахарозы в присутствии или в отсутствие 5 мг/л флуридона (Фл), гербицида, который, как было ранее продемонстрировано, тормозит синтез эндогенной АБК, ингибируя образование каротиноидов [20]. После этого 4-суточные проростки помещали на 24 ч на смесь 2% сахарозы и 1 мМ ацетата кадмия в присутствии или в отсутствие Фл. Другую часть 3-суточных проростков помещали на смесь 2% сахарозы в присутствии или в отсутствие Фл на 3 ч, после чего проростки перекладывали на смесь 2% сахарозы и 0.4 мкМ ЭБ в присутствии или в отсутствие Фл на 24 ч, а затем предобрабо-танные и не обработанные ЭБ 4-суточные проростки инкубировали в течение 24 ч в среде, содержащей 2% сахарозу и 1 мМ ацетат кадмия в присутствии или в отсутствие Фл. Концентрация Фл была подобрана нами ранее как эффективная
для предотвращения стресс-индуцированного накопления АБК [21].
Содержание АБК определяли методом имму-ноферментного анализа с использованием специфичных к АБК кроличьих антител и антикроличьих антител, меченных пероксидазой. Для этого навеску, состоящую из 10 растений, растирали в жидком азоте, затем проводили 16-часовую экстракцию 80% этанолом при 4°C. После центрифугирования (10 мин, 18000 g) суперна-тант упаривали в токе воздуха до водного остатка, из которого экстрагировали АБК с использованием серного эфира. Последовательность иммуно-ферментного анализа была детально описана нами ранее [22].
Содержание дегидринов в проростках определяли методом вестерн-блот анализа с использованием антител, полученных к высоко консервативному К-сегменту дегидринов [23]. Экстракцию белков проводили с использованием буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, 50 мкМ ЭДТА, 5 мМ ß-меркаптоэтанола, 1 мМ PMSF и 10% глицерина. Термостабильную фракцию белков получали инкубированием смеси при 95°C в течение 10 мин. С целью освобождения от клеточных обломков и коагулировавших, чувствительных к термообработке полипептидов гомо-генат центрифугировали 15 мин при 6100 g. Термостабильную фракцию белков осаждали добавлением к образовавшемуся супернатанту 5 объемов охлажденного ацетона. Выровненные по концентрации образцы белков фракционировали в ПААГ в денатурирующих условиях, после чего белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны Protran Membrane ("Whatman", Германия) в приборе Mini Trans-Blot® Module ("BioRad", США), согласно прилагаемой к прибору инструкции. Детекцию связанных на мембране с белками первичных антител проводили с помощью вторичных антител, меченных пероксидазой. Образцы визуализировали с помощью метода хе-милюминесценции с использованием набора реагентов Clarity Western ELC Substrate ("Bio-Rad"). Свечение регистрировали на рентгеновской пленке Retina X-ray XBE ("Carestream Health Inc.", Германия). Количественную оценку проявившихся на пленке образцов проводили с помощью программы Total-Lab.
О нарушении барьерных свойств клеточных мембран проростков судили по выходу электролитов, который регистрировали с использованием кондуктометра ОК 102/1 ("Radelkis", Венгрия), измеряя омическое сопротивление водных экстрактов в постоянном токе. Для этого 1 г растительной навески промывали водопроводной водой и нарезали на одинаковые кусочки. Отрезки вновь промывали водопроводной водой в течение 3 мин, затем ополаскивали дистиллиро-
Ö300
се
«
О ft
i3 200
Б
100
s «
ce *
ft
<D
4
5 0
Время, ч
Рис. 1. Динамика содержания АБК в необработанных и предобработанных в течение 24 ч 5 мг/л флуридоном (Фл) 4-су-точных проростках пшеницы при воздействии 1 мМ ацетата кадмия.
1 — контроль; 2 — кадмий; 3 — Фл + кадмий (3-суточные проростки 24 ч предобрабатывали Фл и подвергали воздействию ацетата кадмия в присутствии Фл).
ванной водой, слегка обсушивали, к навескам приливали по 20 мл дистиллированной воды и инкубировали 1 ч при 25°C, после чего образцы фильтровали, измеряли электропроводность раствора и рассчитывали в мкСм/г сырой массы.
О росте проростков судили по накоплению их сухой и сырой биомассы. Опыты проводили в трех биологических повторах, каждый вариант включал не менее 30 проростков. Митотическую активность меристематических клеток корней анализировали на окрашенных ацетокармином давленых препаратах. Митотический индекс (МИ) клеток апикальной меристемы корней рассчитывали как процент клеток в состоянии митоза на 2000 клеток в каждом варианте [24].
Контролем во всех опытах служили проростки, инкубированные на растворе 2% сахарозы. Эксперименты проводили не менее чем в 3 биологических и 4—5 аналитических повторах. Статистическую
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.