БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 3, с. 488-491
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ АДЕНОЗИНА НА ФОРМУ, МОРФОЛОГИЮ АГРЕГАТОВ И АГРЕГАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ,
ИСТОЩЕННЫХ ПО АТФ
© 2014 г. Ю.А. Шереметьев, А.Н. Поповичева, М.М. Рогозин, Г.Я. Левин
ФГБУ «ННИИТО» Минздравсоцразвития России, 603155, Нижний Новгород, Верхне-Волжская набережная, 18/1 Е-тай:уа.$Нег@гатЫег.гы Поступила в р едакцию 03.12.12 г.
Изучено влияние аденозина на форму, морфологию агрегатов и агрегационную способность эритроцитов, истощенных по АТФ. Показано, что истощение эритроцитов по АТФ приводит к изменению формы эритроцитов: дискоциты превращаются в эхиноциты. Агрегационная способность таких эритроцитов значительно снижалась в аутоплазме. Инкубация эхиноцитов с аденозином восстанавливала дискоидную форму эритроцитов и их агрегационную способность.
Ключевые слова: эритроциты, форма, морфология агрегатов, агрегационная способность, ауто-плазма, АТФ, аденозин.
Известно, что пр оцесс агрегации эритроцитов определяется двумя типами биофизических и физико-химических фактор ов: свойствами плазмы и свойствами самих эритроцитов (главным образом, компонентов мембран) [1].
Среди клеточных факторов агрегации эритроцитов важная роль принадлежит изменению поверхностного заряда и деформируемости [2]. Известно также, что эритроциты эхиноцитар-ной формы имеют сниженную агрегационную способность [3-5].
Ранее нами было показано, что эхиноциты, полученные путем истощения эритроцитов по АТФ, имеют низкую агрегационную способность в аутоплазме [6]. В литературе имеются сведения о том, что инкубация эритроцитов, истощенных по АТФ, с аденозином приводит в значительной степени к восстановлению дис-коидной формы клеток [7-9]. Вопрос о том, восстанавливается ли агрегационная способность эритр оцитов, истощенных по АТФ, после восстановления формы клеток, или этот процесс носит необратимый характер, о стается неясным.
В настоящей работе мы изучали влияние аденозина на форму эритроцитов, истощенных по АТФ, мор фологию агрегатов и агрегационную способность клеток в аутоплазме.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали кровь восьми здоровых доноров. Кровь отбирали в вакуумные
пробирки, содержащие 3,8% цитрата натрия (соотношение 9:1). Бестромбоцитарную плазму получали путем центрифугирования стабилизированной крови в течение 20 мин пр и 3000 об/мин. Тромбоциты и лейкоциты удаляли, а эритроциты трижды промывали физиологическим р аствор ом.
Эритроциты, истощенные по АТФ, получали путем инкубации 10% суспензии клеток в 10 мМ трис-НCl буфере (рН 7,4), содержащем 150 мМ NaCl, при 37°C в течение 24 ч [10]. Через 24 ч полученные эхиноциты инкубиро-вали в течение 2 ч с 5 мМ аденозина [7]. В качестве контроля использовали эритр оциты и плазму, хранящиеся 24 ч при 4°C.
Агрегационную способность эр итроцитов исследовали на приборе (реоскопе) собственной конструкции [11], в котор ом использован принцип, описанный в работе [12]. Для исследования агрегационной способности плазму смешивали с клетками в соотношении 2:1. При оценке процесса агрегации применяли показатель степени агрегации Ма - максимальная амплитуда агрегатогр аммы (мм).
Морфологию агрегатов и форму эритроцитов изучали с помощью светового микроскопа Primo Star (Carl Zeiss, Гер мания). Для исследования морфологии агрегатов плазму смешивали с эритроцитами в соотношении 2:1. После перемешивания каплю крови помещали на предметное стекло и опускали на нее объектив (х100). Для достижения фокуса объекта добав-
ВЛИЯНИЕ АДЕНОЗИНА НА ФОРМУ, МОРФОЛОГИЮ АГРЕГАТОВ
489
Рис. 1. Морфология агрегатов контрольных эритроцитов. Ув. х600.
Рис. 2. Форма эритроцитов, истощенных по АТФ, после их инкубации эритроцитов при 37°С в течение 24 ч. Ув. х600.
ляли небольшое количество плазмы. Для изучения формы эритроциты фиксировали в 0,25% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере (10 мМ Ка2ЫР04, 150 мМ КаС1, рЫ 7,4).
Результаты исследования обработаны методами непараметрической статистики с применением критерия парных сравнений Вилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящей работе кроме агрегации эритроцитов мы изучали также морфологию агр е-гатов. С этой целью опускали объектив микроскопа (х100) на каплю крови (эритроциты, смешанные с бестромбоцитарной плазмой). Мы не наблюдали так называемый эффект стекла, когда нормальные эритроциты трансформируются в эхиноциты при контакте двух стеклянных поверхностей. Связано это, по-видимому, с присутствием в плазме альбумина, который предотвращает эхиноцитоз [13].
На рис. 1 представлена морфология агрегатов контрольных эритроцитов. Видно, что основная масса эритроцитов дискоидной формы вовлекается в агрегаты, образуя «монетные столбики».
Истощение эритроцитов по АТФ приводит к появлению большого количества эхиноцитов (рис. 2). Изучение морфологии агрегатов эрит-
Рис. 3. Морфология агрегатов эритроцитов, истощенных по АТФ, после инкубации эритроцитов при 37°С в течение 24 ч. Ув. х600.
роцитов, истощенных по АТФ, показало резкое снижение агрегационной способности эритро-цитов (рис. 3). Видно, что в агрегаты не вовлекаются эритроциты эхиноцитарной формы. В агрегатах участвуют только клетки дискоид-ной формы, которые образуют «монетные столбики». Степень агрегации эритроцитов, истощенных по АТФ, статистически достоверно снижена по сравнению с контролем (таблица).
Инкубация эритроцитов, истощенных по АТФ, с аденозином в значительной степени восстанавливала дискоидную форму эритроци-
Влияние аденозина на агрегацию эритроцитов, истощенных по АТФ (Ма, мм)
Контроль Эритроциты, истощенные по АТФ
до инкубации с аденозином после инкубации с аденозином
109,88 ± 4,54 20,67 ± 3,36* 66,86 ± 10,28**
Примечание. * р < 0,05 - сравнение с контролем, критерий Вилкоксона. ** р < 0,05 - сравнение с эритроцитами, БИОФИЗИКА том 59 вып. 3 2014
490
ШЕРЕМЕТЬЕВ и др.
шЖР сР&Ё
МнП
Рис. 4. Форма эритроцитов, истощенных по АТФ, после их инкубации при 37°С в течение 24 ч + 2 ч с аденозином (5 мМ). Ув. х600.
тов и агр егационную способность клеток (рис. 4, 5). Статистически значимо увеличивалась степень агрегации эритроцитов после их инкубации с аденозином (таблица).
Таким образом, проведенные исследования показали, что форма эритроцитов играет важную р оль в их агр егации.
Однако механизм повышения агрегацион-ной способности эритр оцитов при восстановлении их дискоидной формы остается неизученным. Можно предположить, что при восстановлении формы эритроцитов открываются участки связывания для белков плазмы крови. Нельзя исключить и тот факт, что у эритро-цитов пр и обр азовании «шипов» происходит нарушение мостикового механизма агрегации, а при восстановлении формы клеток улучшается сближение эритроцитов на наноуровне.
В заключение следует отметить, что изучение морфологии агрегатов эритроцитов при большом увеличении светового микр оскопа позволяет определить прижизненную морфологическую картину агрегатов, что, наряду с определением степени агрегации, дает новую дополнительную информацию о характере взаимодействия клеток.
Рис. 5. Морфология агрегатов эритроцитов, истощенных по АТФ, после инкубации при 37°C в течение 24 ч + 2 ч с аденозином (5 мМ). Ув. х600.
СПИС ОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. O. K. Baskurt and H. J. Meiselman, Semin. Thromb. Hemost. 29 (5), 435 (2003).
2. M. W. Rampling, H. J. Meiselman, B. Neu, and O. K. Baskurt, Biorheology 41 (2), 91 (2004).
3. W. H. Reinhart, A. Singh, and P. W. Straub, Br. J. Haematol. 73 (4), 551 (1989).
4. W. H. Reinhart, G. M. Baerlocher, T. Cerny, et al., Eur. J. Haematol. 62 (4), 223 (1999).
5. W. H. Reinhart and T. Schulzki, Clin. Hemorheol. Microcirc. 49 (1-4), 451 (2011).
6. Ю. А. Шереметьев, А. Н. Поповичева, М. Н. Его-рихина и Г. Я. Левин, Биофизика 58 (2), 264 (2013).
7. M. P. Sheetz, R. G. Painter, and S. J. Singer, J. Cell. Biol. 70 (1), 193 (1976).
8. R. I. Weed, P. L. La Celle, and E. W. Merrill, J. Clin. Invest. 48 (5), 795 (1969).
9. Y. Marikovsky, Mech. Ageing Dev. 86 (2), 137 (1996).
10. S. C. Liu and J. Palek, Blood. 54 (5), 1117 (1979).
11. Г. Я .Левин, А. П. Модин, C. Ю. Кудрицкий и Л. Н. Истина, Патент PO 2278381, опубл. 20.06.06, Бюл. № 17.
12. H. Schmid-Schцnbein, J. von Gosen, L. Heinich, et al., Microvasc. Res. 6 (3), 366 (1973).
13. L. E. Eriksson, Biochim. B^hys. Acta 1036 (3), 193(1990).
ВЛИЯНИЕ АДЕНОЗИНА НА ФОРМУ, МОРФОЛОГИЮ АГРЕГАТОВ
491
Effect of Adenosine on the Shape, Aggregates Morphology and Aggregability of ATP-Depleted Erythrocytes
Yu.A. Sheremet'ev, A.N. Popovicheva, M.M. Rogozin, and G.Ya. Levin
Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Ministry of Health and Social Development of Russia, Verkhne-Voljskaya nab. 18/1, Nizhniy Novgorod, 603155 Russia
The effect of adenosine on the shape, aggregate morphology and aggregability of ATP-depleted erythrocytes was studied. It is shown that the ATP-depletion of erythrocyte leads to the change in their shape: diskocytes transform to echinocytes. It is found that the aggregability of such cells in autoplasma significantly decreased. Incubation of echinocytes with adenosine largely restored discoid shape and erythrocyte aggregability.
Key words: erythrocytes, shape, aggregates morphology, aggregability, autoplasma, ATP, adenosine
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.