РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 2, с. 201-208
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ АДЪЮВАНТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ IN VITRO НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ ЧУМЫ ЛИЦ
© 2015 г. С.Н. Клюева, Т.Н. Щуковская
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"»,
Саратов, Россия
Поступила: 09.02.2015. Принята: 25.05.2015
Проведена оценка влияния in vitro адъювантов нового поколения (агонист TLR3 поли-инозиновая-полицитидиловая кислота Poly(I:C), агонист TLR4 монофосфорилированный липид А (MPL), агонист TLR2 конканавалин А, синтетический полиэлектролит полиокси-доний, синтетический аналог лей-энкефалина даларгин) на продукцию биомаркерных цитокинов Th1 (IL-17, IFNy, TNF-a, IL-8) и Th2 (IL-4) клетками крови вакцинированных и ежегодно ревакцинированных против чумы лиц. У вакцинированных Poly(I:C) стимулировал продукцию всех Th1 (IL-17, TNF-a, IFN-y) и Th2 (IL-4) цитокинов, полиоксидо-ний - Th1 (IL-17) и Th2(IL-4), MPL и конканавалин A - Th1 (IL-17, TNF-a) и Th2 (IL-4), даларгин — Th1 (IL-17, IFN-y) и Th2 (IL-4). У ревакцинированных, напротив, только поли-оксидоний вызывал усиление продукции всех маркерных Th1 (IL-17, TNF-a, IFN-y) и Th2 (IL-4) цитокинов. Poly(I:C) индуцировал Th1 (IL-17, IFN-y и TNF-a), MPL — Th1 (IL-17, IFN-y) и Th2 (IL-4), конканавалин A — Th1 (IFN-y и TNF-a), даларгин — Th1 (IL-17 и IFN-y). Концентрация IgE в сыворотке крови повышалась в допустимых пределах только после первичной вакцинации. Уровень циркулирующих иммунных комплексов во всех случаях значимо не изменялся. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования полиоксидония и Poly(I:C) для оптимизации схемы вакцинации(ревакцинации) против чумы.
Ключевые слова: живая чумная вакцина, адъюванты, цитокины
ВВЕДЕНИЕ
Эпидемии чумы возникали на протяжении всей истории человечества, нанося серьезный ущерб как здоровью населения, так и экономическому развитию [1]. В России с целью надзора за чумой действуют Санитарные правила 3.1.7.2492-09 «Профилактика чумы» [2],
Адрес: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», Клюева Светлана Николаевна. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Авторы:
Клюева С.Н. — к.б.н., н.с., лаборатория вакцинологии и иммунопрофилактики отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», г. Саратов, Россия; Щуковская Т.Н. — д.м.н., профессор, зав. лабораторией вакцинологии и иммунопрофилактики отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», г. Саратов, Россия
предусматривающие проведение комплекса многоплановых профилактических мероприятий, включая вакцинацию, которая внесена в Календарь прививок по эпидемиологическим показаниям (приказ Минздрав-соцразвития РФ № 51н от 31.01.2011 «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям»). Живая сухая чумная вакцина ЕV НИИЭГ (ЖЧВ), производимая в нашей стране, является единственным на сегодняшний день вакцинным препаратом против чумы, имеющим государственную регистрацию. Однако отсутствие длительного напряженного иммунитета требует проведение ежегодной ревакцинации. В этой связи актуальным является оптимизация схемы вакцинации ЖЧВ с применением адъювантов нового поколения для повышения ее эффективности, а также использование перспективных адъю-
вантов для форсификации иммунного ответа организма хозяина в условиях неблагоприятных эпидемиологических ситуаций.
В качестве вакцинных адъювантов применяются агонист TLR4 — монофосфорилиро-ванный липид А (MPL), входящий в состав комбинированного адъюванта ASO4, включенного в вакцину против гепатита В (Беп^х) [3] и вакцину против инфекции, вызываемой вирусом папилломы человека (Сегуапх), а также полиоксидоний (синтетический полиэлектролит), входящий в состав инактиви-рованной вакцины для профилактики гриппа («Гриппол») [4] и противоаллергических вакцин. В настоящее время разрабатывают и испытывают десятки новых адъювантов, которые не вызывают аутоиммунные и другие токсические реакции и адекватно повышают иммунный ответ (клеточный и/или гуморальный). Зарубежные специалисты используют полиинозиновую-полицитидиловую кислоту (Ро1у(1:С)) в качестве адъюванта вакцины для повышения адаптивного противоопухолевого иммунитета [5]. Ро1у(1:С) является аго-нистом TLR3 и представляет собой высокомолекулярную синтетическую двухцепочеч-ную РНК.
В последние годы возрос практический интерес к лекарственным средствам, входящим в группу иммуноактивных препаратов. К таким препаратам относится даларгин — регуляторный пептид, синтетический аналог лей-энкефалина, который за счет связывания со специфическими опиатными рецепторами, обнаруженными в макрофагах, лимфоцитах, тромбоцитах, клетках АПУД-системы, оказывает модулирующее действие на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов, регуляцию баланса ТЫ/1Ъ2-клеток, продукцию цитокинов [6]. Для Т-клеточной митогенной стимуляции клеток крови чаще всего применяют конканавалин А (белок растительного происхождения, вызывающий пролиферацию Т-лимфоцитов), являющийся агонистом TLR2 [7].
Важным критерием эффективности, отражающим клеточное звено противочумного иммунитета, является спонтанная и индуцированная продукция маркерных ТЫ- и Тк2-цитокинов [8]. Состояние гуморального звена противочумного иммунитета оценивают по выработке антител к капсульному антигену чумного микроба (Б1) [9], определению концентраций иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов.
Целью настоящей работы являлась оценка in vitro спонтанной (без воздействия) и индуцированной коммерческими препаратами (Poly(I:C), полиоксидонием, MPL, даларгином и конканавалином А) продукции Th1 (IL-17, IFN-y, TNF-a, IL-8) и Th2 (IL-4) цитокинов клетками крови людей, вакцинированных и ревакцинированных против чумы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлась кровь лиц, первично вакцинированных и ежегодно ревакцинированных (далее по тексту, ревакцинированных) против чумы, в соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ № 51н от 31.01.2011 «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям» и п. 2.2.2.3. СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I —II групп патогенности (опасности)». Вакцинацию людей проводили отечественной коммерческой живой чумной вакциной производства ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспо-требнадзора. Забор крови проводился до и через 1 месяц после вакцинации (ревакцинации).
Для определения продукции цитокинов гепаринизированную венозную кровь разводили в соотношении 1: 4 средой RPMI 1640, содержащей 100 мкг/мл гентамицина. В качестве индукторов продукции цитокинов использовали коммерческие препараты: Poly(I:C) производства InvivoGen, USA (20 мкг/мл), полиоксидоний производства ООО «НПО Петровакс Фарм», Россия (100 мкг/мл), MPL производства Sigma-Aldrich, USA (1 мкг/мл), даларгин производства ФГУ «РКНПК», Россия (2 мкг/мл), стандартный Т-клеточный ми-тоген конканавалин А (Con A) производства ПанЭко, Россия (15 мкг/мл). Контролем служили клетки крови, культивируемые только в среде RPMI-1640. Опытные и контрольные образцы инкубировали в течение 24 часов при температуре 37° С. Затем клеточную суспензию осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин, получали супернатан-ты клеток периферической крови, которые хранили в течение 2 — 3 месяцев при температуре — 70° С.
Концентрацию цитокинов (IL-17, IFN-y, TNF-a, IL-8, IL-4) в клеточных супернатан-
тах и количественное определение иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотках крови определяли с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), применяя коммерческие наборы реагентов (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Расчеты количества цитокинов (пг/мл) и IgE (МЕ/мл) проводили с использованием программы расчета концентраций по многоточечной калибровке после измерения на микропланшетном фотометре Stat Fax-3200 (Awareness Technology, США) при длине волны 450 нм.
Образцы сыворотки получали из венозной крови, инкубированной в пробирках с Clot Activator «VACUTEST» в течение 1 ч, а затем центрифугированной при 400 g. Контролем служили сыворотки крови ранее не вакцинированных против чумы людей (группа первично вакцинированных лиц до вакцинации).
Антитела к FI Y. pestis в сыворотках крови лиц, вакцинированных ЖЧВ, определяли ИФА с помощью иммуноферментной тест-системы (ИФА-АТ-Ф1 YERSINIA PESTIS) производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Учет оптической плотности осуществляли с использованием фотометра Stat Fax-3200 при длине волны 405 нм, принимая за положительный результат значение оптической плотности, не менее чем в 3 раза превышающее таковое в отрицательном контроле. Активность антител в сыворотке определяли в трех повторах и выражали в виде обратного среднегеометрического титра и его средней квадратической ошибки.
Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотках крови определяли на спектрофотометре Genesys 10S UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, США) методом преципитации 3,5%-ным раствором полиэтилен-гликоля по изменению величины светового рассеяния [10].
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2010. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различие средних показателей считалось достоверным при уровне значимости менее 0,05. Полученные данные представляли в виде М±т, где М — среднее значение анализируемого показателя, m — средняя квадратическая ошибка средней арифметической.
РЕЗУЛЬТАТЫ
После первичной вакцинации в опытах in vitro зафиксировано достоверное нарастание спонтанной продукции IL-17, IFN-y, TNF-a и IL-4, в сравнении с показателями до вакцинации (табл. 1).
В результате иммуноферментного анализа установлена различная цитокин-индуцирую-щая активность изученных преп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.