научная статья по теме ВЛИЯНИЕ АДЪЮВАНТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ IN VITRO НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ ЧУМЫ ЛИЦ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ АДЪЮВАНТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ IN VITRO НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ ЧУМЫ ЛИЦ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 2, с. 201-208

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

ВЛИЯНИЕ АДЪЮВАНТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ IN VITRO НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ КРОВИ ВАКЦИНИРОВАННЫХ ПРОТИВ ЧУМЫ ЛИЦ

© 2015 г. С.Н. Клюева, Т.Н. Щуковская

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"»,

Саратов, Россия

Поступила: 09.02.2015. Принята: 25.05.2015

Проведена оценка влияния in vitro адъювантов нового поколения (агонист TLR3 поли-инозиновая-полицитидиловая кислота Poly(I:C), агонист TLR4 монофосфорилированный липид А (MPL), агонист TLR2 конканавалин А, синтетический полиэлектролит полиокси-доний, синтетический аналог лей-энкефалина даларгин) на продукцию биомаркерных цитокинов Th1 (IL-17, IFNy, TNF-a, IL-8) и Th2 (IL-4) клетками крови вакцинированных и ежегодно ревакцинированных против чумы лиц. У вакцинированных Poly(I:C) стимулировал продукцию всех Th1 (IL-17, TNF-a, IFN-y) и Th2 (IL-4) цитокинов, полиоксидо-ний - Th1 (IL-17) и Th2(IL-4), MPL и конканавалин A - Th1 (IL-17, TNF-a) и Th2 (IL-4), даларгин — Th1 (IL-17, IFN-y) и Th2 (IL-4). У ревакцинированных, напротив, только поли-оксидоний вызывал усиление продукции всех маркерных Th1 (IL-17, TNF-a, IFN-y) и Th2 (IL-4) цитокинов. Poly(I:C) индуцировал Th1 (IL-17, IFN-y и TNF-a), MPL — Th1 (IL-17, IFN-y) и Th2 (IL-4), конканавалин A — Th1 (IFN-y и TNF-a), даларгин — Th1 (IL-17 и IFN-y). Концентрация IgE в сыворотке крови повышалась в допустимых пределах только после первичной вакцинации. Уровень циркулирующих иммунных комплексов во всех случаях значимо не изменялся. Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования полиоксидония и Poly(I:C) для оптимизации схемы вакцинации(ревакцинации) против чумы.

Ключевые слова: живая чумная вакцина, адъюванты, цитокины

ВВЕДЕНИЕ

Эпидемии чумы возникали на протяжении всей истории человечества, нанося серьезный ущерб как здоровью населения, так и экономическому развитию [1]. В России с целью надзора за чумой действуют Санитарные правила 3.1.7.2492-09 «Профилактика чумы» [2],

Адрес: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», Клюева Светлана Николаевна. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Авторы:

Клюева С.Н. — к.б.н., н.с., лаборатория вакцинологии и иммунопрофилактики отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», г. Саратов, Россия; Щуковская Т.Н. — д.м.н., профессор, зав. лабораторией вакцинологии и иммунопрофилактики отдела иммунологии, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», г. Саратов, Россия

предусматривающие проведение комплекса многоплановых профилактических мероприятий, включая вакцинацию, которая внесена в Календарь прививок по эпидемиологическим показаниям (приказ Минздрав-соцразвития РФ № 51н от 31.01.2011 «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям»). Живая сухая чумная вакцина ЕV НИИЭГ (ЖЧВ), производимая в нашей стране, является единственным на сегодняшний день вакцинным препаратом против чумы, имеющим государственную регистрацию. Однако отсутствие длительного напряженного иммунитета требует проведение ежегодной ревакцинации. В этой связи актуальным является оптимизация схемы вакцинации ЖЧВ с применением адъювантов нового поколения для повышения ее эффективности, а также использование перспективных адъю-

вантов для форсификации иммунного ответа организма хозяина в условиях неблагоприятных эпидемиологических ситуаций.

В качестве вакцинных адъювантов применяются агонист TLR4 — монофосфорилиро-ванный липид А (MPL), входящий в состав комбинированного адъюванта ASO4, включенного в вакцину против гепатита В (Беп^х) [3] и вакцину против инфекции, вызываемой вирусом папилломы человека (Сегуапх), а также полиоксидоний (синтетический полиэлектролит), входящий в состав инактиви-рованной вакцины для профилактики гриппа («Гриппол») [4] и противоаллергических вакцин. В настоящее время разрабатывают и испытывают десятки новых адъювантов, которые не вызывают аутоиммунные и другие токсические реакции и адекватно повышают иммунный ответ (клеточный и/или гуморальный). Зарубежные специалисты используют полиинозиновую-полицитидиловую кислоту (Ро1у(1:С)) в качестве адъюванта вакцины для повышения адаптивного противоопухолевого иммунитета [5]. Ро1у(1:С) является аго-нистом TLR3 и представляет собой высокомолекулярную синтетическую двухцепочеч-ную РНК.

В последние годы возрос практический интерес к лекарственным средствам, входящим в группу иммуноактивных препаратов. К таким препаратам относится даларгин — регуляторный пептид, синтетический аналог лей-энкефалина, который за счет связывания со специфическими опиатными рецепторами, обнаруженными в макрофагах, лимфоцитах, тромбоцитах, клетках АПУД-системы, оказывает модулирующее действие на функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов, регуляцию баланса ТЫ/1Ъ2-клеток, продукцию цитокинов [6]. Для Т-клеточной митогенной стимуляции клеток крови чаще всего применяют конканавалин А (белок растительного происхождения, вызывающий пролиферацию Т-лимфоцитов), являющийся агонистом TLR2 [7].

Важным критерием эффективности, отражающим клеточное звено противочумного иммунитета, является спонтанная и индуцированная продукция маркерных ТЫ- и Тк2-цитокинов [8]. Состояние гуморального звена противочумного иммунитета оценивают по выработке антител к капсульному антигену чумного микроба (Б1) [9], определению концентраций иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов.

Целью настоящей работы являлась оценка in vitro спонтанной (без воздействия) и индуцированной коммерческими препаратами (Poly(I:C), полиоксидонием, MPL, даларгином и конканавалином А) продукции Th1 (IL-17, IFN-y, TNF-a, IL-8) и Th2 (IL-4) цитокинов клетками крови людей, вакцинированных и ревакцинированных против чумы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлась кровь лиц, первично вакцинированных и ежегодно ревакцинированных (далее по тексту, ревакцинированных) против чумы, в соответствии с приказом Минздравсоцразвития РФ № 51н от 31.01.2011 «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям» и п. 2.2.2.3. СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I —II групп патогенности (опасности)». Вакцинацию людей проводили отечественной коммерческой живой чумной вакциной производства ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспо-требнадзора. Забор крови проводился до и через 1 месяц после вакцинации (ревакцинации).

Для определения продукции цитокинов гепаринизированную венозную кровь разводили в соотношении 1: 4 средой RPMI 1640, содержащей 100 мкг/мл гентамицина. В качестве индукторов продукции цитокинов использовали коммерческие препараты: Poly(I:C) производства InvivoGen, USA (20 мкг/мл), полиоксидоний производства ООО «НПО Петровакс Фарм», Россия (100 мкг/мл), MPL производства Sigma-Aldrich, USA (1 мкг/мл), даларгин производства ФГУ «РКНПК», Россия (2 мкг/мл), стандартный Т-клеточный ми-тоген конканавалин А (Con A) производства ПанЭко, Россия (15 мкг/мл). Контролем служили клетки крови, культивируемые только в среде RPMI-1640. Опытные и контрольные образцы инкубировали в течение 24 часов при температуре 37° С. Затем клеточную суспензию осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин, получали супернатан-ты клеток периферической крови, которые хранили в течение 2 — 3 месяцев при температуре — 70° С.

Концентрацию цитокинов (IL-17, IFN-y, TNF-a, IL-8, IL-4) в клеточных супернатан-

тах и количественное определение иммуноглобулина Е (IgE) в сыворотках крови определяли с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), применяя коммерческие наборы реагентов (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Расчеты количества цитокинов (пг/мл) и IgE (МЕ/мл) проводили с использованием программы расчета концентраций по многоточечной калибровке после измерения на микропланшетном фотометре Stat Fax-3200 (Awareness Technology, США) при длине волны 450 нм.

Образцы сыворотки получали из венозной крови, инкубированной в пробирках с Clot Activator «VACUTEST» в течение 1 ч, а затем центрифугированной при 400 g. Контролем служили сыворотки крови ранее не вакцинированных против чумы людей (группа первично вакцинированных лиц до вакцинации).

Антитела к FI Y. pestis в сыворотках крови лиц, вакцинированных ЖЧВ, определяли ИФА с помощью иммуноферментной тест-системы (ИФА-АТ-Ф1 YERSINIA PESTIS) производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Учет оптической плотности осуществляли с использованием фотометра Stat Fax-3200 при длине волны 405 нм, принимая за положительный результат значение оптической плотности, не менее чем в 3 раза превышающее таковое в отрицательном контроле. Активность антител в сыворотке определяли в трех повторах и выражали в виде обратного среднегеометрического титра и его средней квадратической ошибки.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотках крови определяли на спектрофотометре Genesys 10S UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, США) методом преципитации 3,5%-ным раствором полиэтилен-гликоля по изменению величины светового рассеяния [10].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2010. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различие средних показателей считалось достоверным при уровне значимости менее 0,05. Полученные данные представляли в виде М±т, где М — среднее значение анализируемого показателя, m — средняя квадратическая ошибка средней арифметической.

РЕЗУЛЬТАТЫ

После первичной вакцинации в опытах in vitro зафиксировано достоверное нарастание спонтанной продукции IL-17, IFN-y, TNF-a и IL-4, в сравнении с показателями до вакцинации (табл. 1).

В результате иммуноферментного анализа установлена различная цитокин-индуцирую-щая активность изученных преп

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»