РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 50-57
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ АФОБАЗОЛА НА ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В СИСТЕМЕ IN VITRO
© 2009 г. С.В. Сибиряк, Ф.Г. Разумная, М.Х. Салимгареева, С.В. Садовников, С.Б. Середенин*, В.А. Вахитов
Институт биохимии и генетики УфНЦРАН, г. Уфа, Россия;
*НИИ фармакологии РАМН, Москва, Россия
Поступила: 15.01.09 г. Принята: 02.02.09 г.
Изучено влияние селективного анксиолитика и нейропротектора афобазола (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]) бензимидазола дигидрохлорида) на индуцированную антиСЭЭ МКА и PHA пролиферацию лимфоцитов здоровых доноров в системе in vitro. В 72-часовых культурах мононуклеаров афобазол в концентрации 0,1 — 100 мкг/мл подавлял митоген-ный ответ лимфоцитов, индуцированный антиСЭЭ МКА, а в концентрации 10 мкг/мл и 100 мкг/мл митогенный ответ лимфоцитов, индуцированный PHA-P. Афобазол (10 мкг/мл) подавлял также индуцированный PHA митогенный ответ изолированной от моноцитов фракции лимфоцитов. Ингибиторный эффект препарата сопровождался снижением числа митотически активных клеток и интенсивности активационного апоптоза. При внесении в культуру через 48 часов после добавления митогенов и последующей 24-часовой инкубации афобазол (0,1 и 10 мкг/мл) в равной мере подавлял митогенный ответ клеток как при стимуляции антиСЭЭ МКА, так и PHA, что сопровождалось как снижением интенсивности митогенеза, так и незначительным усилением апоптоза.
Ключевые слова: афобазол, лимфоциты, митогенный ответ
ВВЕДЕНИЕ
Многие фармакологические препараты, не являясь «профессиональными иммуномоду-ляторами», обладают выраженным влиянием на врожденные и адаптивные механизмы функционирования иммунной системы [1]. Это может быть обусловлено как особенностями их химической структуры, так и основным фармакологическим действием. Иммунотропный эффект может вносить существенный вклад в спектр нежелательных лекарственных реакций, а может быть и важной составляющей терапевтического эффекта препарата. Особый интерес представляют производные бензимидазола (и его конденсированные гетероциклические системы), которые широко используются в медицине в качестве актопротекторов, антигельминти-ков, противоязвенных, антиаллергических средств и пр. Подавляющее большинство производных бензимидазола обладает имму-нотропными свойствами, среди них есть пре-
Адрес: 450093, Уфа, ул. Пушкина д. 54/1, кв. 58. E-mail: S.Sibiryak@gmail.com
параты и соединения как иммуностимулирующего, так и иммуносупрессивного действия [2].
Афобазол (5-этокси — 2- [2- (морфолино) -этилтио] бензимидазола дигидрохлорид) разработан НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова и является селективным анксио-литиком и нейропротектором [3, 4]. Основной фармакологический эффект афобазола связывают с модуляцией активности GABAa рецепторов и способностью увеличивать уровень BDNF в структурах мозга [5, 6]. Установлено, что афобазол препятствует негативному воздействию стресса на кроветворную систему при сублетальном облученнии [7], обладает антимутагенным эффектом [8], препятствует сверхэкспрессии На-ras и р53 в тимусе, костном мозге и лимфоидных органах и обладает хемопревентивным эффектом [9]. Эти факты предполагают возможность прямого воздействия афобазола на иммуноком-петентные клетки.
Целью настоящей работы явилась оценка влияния афобазола на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров в системе in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования явились монону-клеары периферической крови 30 здоровых доноров-добровольцев. Группа доноров состояла из 22 мужчин и 18 женщин в возрасте 20 — 40 лет. Все доноры были поставлены в известность о проводимом исследовании и дали согласие на участие в нем. Процедуру взятия крови осуществляли строго натощак. Кровь брали из локтевой вены в стерильных условиях в утренние часы, в качестве антикоагулянта использован 5% ЭДТА-К3 (Sigma).
Мононуклеары выделяли из крови стандартным методом градиентного центрифугирования (Histopague 1,077, Sigma). После двукратного отмывания средой RPMI— 1640 (Sigma) клетки ресуспендировали в обогащенной глутамином среде RPMI—1640, содержащей 10% ЭТС (Sigma), и 50 мкг/мл ген-тамицина сульфата (Sigma). Концентрация клеток составляла 1 х 106 клеток/мл.
В ряде опытов осуществляли дальнейшее фракционирование мононуклеаров на лимфоциты и моноциты, применяя ступенчатый (60, 47,5, 34%) градиент изотонического перколла (Pharmacia) по методу, описанному [10]. Эффективность разделения популяций контролировали с помощью иммунофеноти-пирования, используя моноклональные антитела CD45-FITC-IgG1/CD14-Pe-IgG1 (IOTEST, Beckman Coulter) и последующую проточную цитофлуорометрию.
Культивирование клеток осуществляли в течение 72 часов в лунках 48-луночных планшет (Costar) (5 х 105 клеток) при 37 °С, в атмосфере, содержащей 5% CO2. В качестве митогенов использовали антиCD3 МКА (НПЦ «МедБиоСпектр»), PHA-P (Difco). Афобазол, — субстанцию (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио]) бензимидазола дигид-рохлорида, разводили средой RPMI-1640 и использовали в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл (0,33 — 330 мкмоль/литр).
Пролиферативную активность оценивали с помощью колориметрического «Alamar blue-теста» [11, 12]. Кратко, за 6 часов до окончания культивирования в культуры добавляли коммерческий раствор Alamar blueTM (Biosource) в количестве, рекомендованном производителем (1/10 объема культуры). По окончанию культивирования, показатель пролиферативной активности клеток определяли, как разницу между оптической плотно-
стью культуральнои среды при длинах волн 570 и 600 нм, Д570нм-б00нм (спектрофотометр SmartSpectTMPlus, BioRad).
В ряде случаев использован стандартный радиометрический метод оценки пролиферации. Для этого за 6 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили 1мкКю 3Н-тимидина. По окончанию инкубации клетки переносили на нитроцеллюлозные фильтры с помощью сборщика клеток. Радиоактивность измеряли на сцинцилляционном мультианализаторе Hidex (Finland).
Для оценки апоптоза и структуры клеточного цикла использован стандартный метод окрашивания фиксированных ледяным 700 этанолом клеток йодистым пропидием в присутствии РНКазы-A (Sigma) (20 мкг/мл йодистого пропидия, 100 мкг/мл РНКазы-А). Цитофлуорометрию осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (BD) или Cytomics FC500 (Beckman Coulter), анализ данных в рамках программного обеспечения FCS Express V3 Reseach Edition (DenovoSoftware)
Статистическая обработка результатов произведена в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6,0). Использовали параметрические (критерий Стьюдента для сопряженных признаков, PSt) и непараметрические (критерий Вилкоксона, Pw) критерии различия.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние афобазола на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов периферической крови при его добавлении в культуру одновременно с митогенами
При добавлении к нестимулированным митогенами клеткам, в диапазоне концентраций 0,1 — 10 мкг/мл препарат вызывал незначительное нарастание интенсивности спонтанной пролиферативной активности клеток в 72-часовых культурах, однако статистически значимых отличий, в сравнении с контрольными культурами, не было. В концентрации 100 мкг/мл афобазол не изменял спонтанной пролиферативной активности (Табл. 1).
В культурах лимфоцитов, стимулированных антиCD3 МКА, в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкг/мл афобазол вызывал снижение пролиферативной активности Т лимфоцитов. Огатистически значимое снижение, в сравнении с контрольными культурами, отмечалось при использовании препарата в
Таблица 1. Влияние афобазола (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорида) на пролифе-ративную активность лимфоцитов периферической крови здоровых доноров в 72-часовых культурах при его добавлении в культуру одновременно с митогенами
Условия культивирования АнтиСБЗ МКА, 2,5 мкг/мл (п=12) РНА-Р 10 мкг/мл (п=10)
Мито-ген Афобазол, мкг/мл
0,1 1 10 100 ДОП570_600 нм ИС РБТЛ ДОП570 — 600 нм ИС РБТЛ
57,4 ± 36,5 46,0 ± 37,5
+ 62,3 ± 46,7 56,3 ± 48,9
+ 61,6 ± 48,6 55,8 ± 51,3
+ 61,0 ± 36,0 56,5 ± 40,2
+ 49,0 ± 9,3 48,6 ± 31,2
+ 328,1 ± 138,9 7,4 ± 4,6 559,2 ± 204,4 18,9 ± 13,0
+ + 252,8 ± 161,7 4,6 ± 2,1 528,7 ± 165,6 13,7 ± 8,3
Ра = 0,027 Ра = 0,007 Р54 = 0,003
+ + 271,5 ± 172,9 5,3 ± 3,5 564,5 ± 216,8 12,0 ± 9,3
Ра = 0,07 Ра = 0,007 Ра = 0,004
+ + 249,0 ± 154,0 4,7 ± 2,8 249,0 ± 154,0 12,7 ± 8,8
Ра = 0,007 Р54 = 0.007 Ра = 0,04 Ра = 0,002
+ + 71,8 ± 40,0 2,1 ± 0,9 71,8 ± 40,0 3,3 ± 1,7
Ра = 0,011 Ра = 0,03 Р54 = 0,03 Ра = 0,01
Примечание: Здесь и далее данные представлены, как среднее значение ± стандартное отклонение (М ± ЯБ). Ра — критерий Стьюдента для сопряженных признаков.
Таблица 2. Влияние афобазола на интенсивность апоптоза и структуру клеточного цикла стимулированных антиСБЗ МКА лимфоцитов периферической крови здоровых доноров
Условия культивирования Относительное содержание клеток, % (М ± ЯБ)
АнтиСБ 3 МКА Афобазол, мкг/мл Апоптоз (гипо-диплоидный пик, < 2п) С0 + С1 (2п) Я+ С2 + М (> 2п - 4п)
0,1 1,0 10,0 100,0
Инкубация в присутствии афобазола 72 часа (п = 6)
+ + + + + + + + + 4,27 ± 1,20 3,60 ± 1,16 3,77 ± 1,91 2,92 ± 0,59* 1,60 ± 0,36* 69,86 ± 4,30 69,40 ± 8,20 70,16 ± 5,55 76,31 ± 5,31* 86,82 ± 0,19* 18.97 ± 3,51 17.98 ± 5,41 16,82 ± 4,53 14,55 ± 3,42* 7,08 ± 1,16*
Добавление афобазола за 24 часа до окончания культивирования (п = 5)
+ + + + + 7,15 ± 4,21 8,00 ± 4,32 7,47 ± 4,20 71,36 ± 6,84 72,79 ± 6,57 72,90 ± 6,25 12,94 ± 3,87 11,63 ± 3,49* 12,50 ± 2,51
Примечание: 'статистически значимое (Рш <0,05, парный критерий Вилкоксона) изменение в сравнении с контрольными, не содержащими препарата, культурами.
концентрации 0,1 мкг/мл и 10 мкг/мл, а в максимальной концентрации (100 мкг/мл) афобазол практически полностью блокировал пролиферацию клеток. Токсического воздействия на клетки, судя по тесту с 0,2% трипановым синим, препарат не оказывал. И
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.