ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 4, с. 409-416
УДК 577.114:581.143
ВЛИЯНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ rol НА СОДЕРЖАНИЕ, СТРОЕНИЕ ПЕКТИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ И АКТИВНОСТЬ ГЛИКАНАЗ В КУЛЬТУРАХ ТРАНСГЕННЫХ КЛЕТОК Rubia cordifolia
© 2013 г. Е. А. Гюнтер*, О. В. Попейко*, Ю. Н. Шкрыль**, Г. Н. Веремейчик**,
В. П. Булгаков**, ***, Ю. С. Оводов*
*Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар, 167982
e-mail: gunter@physiol.komisc.ru **Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток, 690022 e-mail: yn80@mail.ru ***Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, 690950 e-mail: bulgakov@ibss.dvo.ru Поступила в редакцию 08.10.2012 г.
Эспрессия гена rolB приводила к увеличению содержания пектинов в клетках марены сердцелист-ной (Rubia cordifolia L.), тогда как включение гена rolC вызывало снижение синтеза пектинов, которое зависело от уровня его экспрессии. В результате экспрессии генов rolA, rolB и rolC происходило увеличение содержания арабиногалактана (АГ) в клетках. С увеличением уровня экспрессии генов rolB и rolC происходило более существенное снижение содержания остатков арабинозы в пектине, что сопровождалось ростом активности a-L-арабинофуранозидазы в клетках. Кроме того, с увеличением уровня экспрессии гена rolB увеличивалось количество остатков галактозы в пектине, которое было обусловлено снижением активности Р-галактозидазы в клетках. Снижение содержания остатков галактуроновой кислоты в пектине усиливалось в ряду от rolC к rolB и rolA трансгенов. Независимо от типа гена снижалось содержание остатков арабинозы в АГ. С увеличением уровня экспрессии гена rolB происходило более существенное снижение содержания остатков арабинозы в АГ.
Б01: 10.7868/80555109913040065
Пектиновые вещества включают пектиновые полисахариды (гомогалактуронан, рамногалакту-ронаны I и II, ксилогалактуронан и апиогалакту-ронан) и сопутствующие арабинаны, галактаны и арабиногалактаны [1]. Эти полисахариды входят в состав клеточных стенок практически всех высших наземных и водных растений и выполняют важные биологические функции [1, 2]. Интерес к ним обусловлен также их высокой физиологической активностью и ценными техническими свойствами. Известно, что биологические функции и физиологическая активность растительных полисахаридов определяется особенностями их строения [3—5]. В связи с этим актуален поиск эффективных источников сырья и методов модификации полисахаридов с целью получения полимеров с заданными структурой и свойствами.
Разработка способов направленного изменения активности ферментов клеточной стенки откроет возможность получения полисахаридов с конкретными ценными свойствами и определенной структурой [6]. Модификация структуры пектиновых веществ в культурах клеток растений под действием агробактериальных генов может
служить одним из подходов для получения полисахаридов с заданным строением и свойствами.
Различные методические приемы клеточной и генетической инженерии стали составной частью современной молекулярной и клеточной биологии, биохимии и биотехнологии, благодаря которым стало возможным получение модифицированных полисахаридов. Для изучения функции пектинов в растениях и взаимосвязи структуры и функции пектиновых веществ применяют два подхода: 1) получение мутантных форм растений с измененной морфологией и строением пектина; 2) экспрессия в растениях чужеродных генов, кодирующих активность гликаназ (гликозидгидро-лаз) [7-10].
Перспективным направлением является использование для модификации пектиновых веществ регуляторных генов rol. Гены rolA, rolB и rolC, выделенные из Т-ДНК Ri плазмид почвенных бактерий Agrobacterium rhizogenes штамма А4, участвуют в индукции образования "волосатых корней" (hairy roots) в трансформированных растениях, оказывают влияние на рост и развитие растений, а также являются активаторами вто-
ричного метаболизма растений [11, 12]. Известно, что трансформация генами rolB и rolC различных видов растений вызывала морфологические аномалии, такие, как уменьшение веса растений и длины междоузлий, увеличение разветвленно-сти, уменьшение размера цветков и листьев. Кроме того, трансформация индуцировала образование корней, указывая на ауксинподобный эффект этих генов [13, 14].
Изменение продукции первичных метаболитов растения, в частности полисахаридов и ферментов, при трансформации генами rol не изучено. Было только показано, что в культурах клеток женьшеня Panax ginseng, трансформированных агробактериальными генами rolC, происходило увеличение активности карбогидраз, таких, как а- и P-D-галактозидазы [15] и 1,3-Р^-глюкана-зы [16]. Данные ферменты действуют на полисахариды растительной клеточной стенки, в частности на структуру боковых цепей пектинов и арабиногалактанов. До настоящего времени не проводились исследования по выяснению роли генов rol в регуляции активности гликаназ, особенностей строения и биосинтеза растительных полисахаридов.
В качестве модельной системы были выбраны трансгенные каллусные культуры лекарственного растения марены сердцелистной Rubia cordifolia L., экспрессия генов rol в которых активировала биосинтез антрахинонов [17].
Цель работы — выяснение роли агробактери-альных генов rol в регуляции биосинтеза полисахаридов и активности гликаназ растительных клеток.
МЕТОДИКА
Контрольная и трансформированные культуры Rubia cordifolia L. Каллусные культуры получены из листьев трехнедельного стерильного микрорастения Rubia cordifolia L. [17]. Нетрансформи-рованную культуру, которую использовали в качестве контроля, обозначали R. Все трансгенные культуры марены сердцелистной были получены из листьев того же растения путем агробактери-альной трансформации с помощью штамма Agro-bacterium tumefaciens GV3101, содержащего гены rol в составе бинарного вектора pPCV002 [18], как описано ранее [19]. Трансгенные культуры с низким, средним и высоким уровнем экспрессии генов rolB и rolC были обозначены RBL, RBM, RBH и RCL, RCM, RCH соответственно. Корнеобразу-ющие каллусная и суспензионная культуры с высокой экспрессией гена rolC обозначены RCH-RC (RCH-roots callus) и RCH-RS (RCH-roots suspension) соответственно. RolA-трансгенная культура обозначена RA. Трансгенная культура RA4 с совместной экспрессией генов rol была получена пу-
тем трансформации диким штаммом Agrobacteri-um rhizogenes A4 [20]. Как контрольная, так и трансгенные культуры обладали стабильными ростовыми характеристиками и были подробно описаны ранее [21]. Условия культивирования и составы сред были идентичны для контрольной и трансгенных культур: каллусы выращивали в колбах Эрленмейера объемом 100 мл при 25°С в темноте на среде WB/A [17], содержащей 0.5 мг/л 6-бензиламино-пурина и 2.0 мг/л а-нафтилуксусной кислоты. Каллусы субкультивировали с интервалом 30 сут.
Выделение полисахаридов. Сухую биомассу исчерпывающе экстрагировали в аппарате Сокслета органическими растворителями (метанолом и хлороформом) для удаления низкомолекулярных примесей. Полисахариды из воздушно-сухого остатка биомассы выделяли как описано в работе [22]. В результате получали две фракции полисахаридов: пектин и арабиногалактан (АГ). Содержание полисахаридных фракций представляли в процентах от сухой биомассы, предварительно обработанной метанолом и хлороформом. Эксперименты проводили 3 раза.
Общие аналитические методы. Во фракциях полисахаридов определяли содержание гликуро-новых кислот по реакции с 3,5-диметилфенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [23], содержание белка определяли методом Лоури. Общее содержание углеводов устанавливали по реакции с фенолом в присутствии серной кислоты [24]. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 ("Pharmacia Biotech", Великобритания). ГЖХ выполняли на приборе Hewlett-Packard 4890А ("Hewlett-Packard", США) с пламенно-ионизационным детектором и интегратором НР 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (0.25 мм х 30 м) ("Restek", США), газ-носитель — аргон. Сред-невесовую (Mw) и среднечисловую (Mn) молекулярную массу полисахаридов определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, которую проводили, как описанно ранее [25]. Образец (2—3 мг) растворяли в 1.0 мл 0.15 М раствора NaCl в бидистиллированной воде и фильтровали. Для анализа использовали хрома-тографическую систему: насос SD-200 ("Dy-namax", США), колонку Shodex Asahipak GS-620HQ (7.6 мм х 30 см) ("Shimadzu", Япония) и предколонку Shodex GS-26 7B (7.6 мм х 5 см) ("Shimadzu", Япония), термостат CTD-10AS ("Shimadzu", Япония), детектор-рефрактометр RID G136A ("Shimadzu", Япония). Элюирование проводили 0.15 М NaCl при 40°C со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для калибровки колонки использовали декстрансульфаты с молекулярными массами 36-50, 400-600 и 1400 кДа ("Sigma", США).
Полный кислотный гидролиз. Полисахаридные фракции (по 2.0—2.5 мг) гидролизовали 2.0 М три-фторуксусной кислотой (1.0 мл) при 100°C в течение 3—4 ч. Затем гидролизаты упаривали в вакууме с метиловым спиртом до полного удаления трифтор-уксусной кислоты. В качестве внутреннего стандарта использовали миоинозит (0.5 мг/мл). Моносахариды идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [26].
Анализ активности гликаназ. Биомассу гомогенизировали в 0.05 М натрий-ацетатном буфере, рН 5.0, соотношение биомасса—буфер 1 : 10, центрифугировали при 10000 g 20 мин. Затем супернатант диализовали 3 сут против 0.05 М натрий-ацетатного буфера, рН 5.0, при 4°C и центрифугировали. В су-пернатанте определяли активность внутриклеточных ферментов. Агаризованную культуральную среду центрифугировали при 10000 g 20 мин, супернатант диализовали 3 сут против 0.05 М натрий-ацетатного буфера, рН 5.0, при 4°C и снова центрифугировали. В супернатанте определяли активность внеклеточных ферментов.
Активность полигалактуроназы определяли по накоплению редуцирующих сахаров после 10 мин инкубации раствора фермента при 50°C с 1%-ной полигалактуроновой кислотой ("ICN", США) в 0.05 М натрий-ацетатном буфере, рН 4.6. Образовавшиеся восстанавливающие сахара определяли методом Нельсона—Сомоджи [27]. Калибровочный график строили по D-галакт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.