УДК 577.112.6:577.175.53
ВЛИЯНИЕ АКТГ-ПОДОБНОГО ПЕПТИДА ИММУНОКОРТИНА НА АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ КРЫСЫ
© 2004 г. Е. В. Наволоцкая*#, В. И. Ванина*, Т. А. Заргарова*, Е. Н. Гончаренко**, Н. Ю. Кудряшова**, М. Я. Ахалая**, В. Б. Садовников*, С. Г. Семушина*, А. А. Колобов***, Е. А. Камле-Немм***, В. В. Юровский****, В. М. Липкин*
*Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142292, Московская область, г. Пущино, просп. Науки, 6; **Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва; ***ГНЦ Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов,
Санкт-Петербург; ****Медицинский факультет университета Мэриленд, Балтимор, США Поступила в редакцию 10.02.2003 г. Принята к печати 11.03.2003 г.
Исследовано влияние АКТГ-подобного декапептида иммунокортина VKKPGSSVKV, соответствующего аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части тяжелой цепи IgGl человека, на содержание 11-оксикортикостероидов (КС) в надпочечниках и плазме крови крыс in vivo. Установлено, что через 1 ч после внутримышечной инъекции иммунокортина в дозе 10 мкг/кг содержание КС в надпочечниках снижалось в 2 раза, в плазме, напротив, этот показатель увеличивался в 1.8 раза. В то же время введение иммунокортина в дозе 100 мкг/кг практически не влияло на содержание КС, а в дозе 1000 мкг/кг вызывало повышение уровня КС и в надпочечниках, и в плазме соответственно в 1.6 и 2.2 раза. Через 4 ч после введения любой из трех доз иммунокортина - 10, 100 или 1000 мкг/кг - содержание КС в надпочечниках не отличалось от контрольного, а через 24 ч снижалось в 3 раза. Показано, что иммунокортин с высоким сродством и специфичностью связывается с рецепторами АКТГ на мембранах коры надпочечников крысы (ингибирует специфическое связывание 1251-меченого АКТГ-(11-24)-пептида с К{ 1.2 нМ).
Ключевые слова: адренокортикотропный гормон, глюкокортикоиды, иммуноглобулин G, пептиды, рецепторы, кора надпочечников, эндокринная система.
ВВЕДЕНИЕ
Эндогенные пептиды участвуют в регуляции функций эндокринной, нервной, иммунной, сер-дечно-сосудистой и других систем организма человека и животных. Большинство пептидных гормонов образуются в результате процессинга неактивных белковых предшественников в клетках эндокринных желез и секретируются в кровеносное русло. В то же время последовательности ряда эндогенных регуляторных пептидов обнаружены в составе биологически активных белков: иммуноглобулине в (тафтсин и р23), гемоглобине (геморфины и киоторфины), казеине (казоморфи-ны), альбумине (кинетензин) и некоторых других белках. В отличие от классических пептидных гормонов эти пептиды образуются в результате специфического ферментативного расщепления родительских белковых молекул в непосредственной
Сокращения: АКТГ - адренокортикотропный гормон;
ИМК - иммунокортин; КС - 11-оксикортикостероиды. #Автор для переписки (тел.: (27) 73-66-68; факс: (27) 79-05-
27; эл. почта: navolots@fibkh.serpukhov.su).
близости от рецепторных систем клеток-мишеней, поэтому расстояние между точками их образования и действия сопоставимо с размерами клеток.
В начале 1980-х годов американские исследователи Джуллиард и др. [1], Хоук и др. [2] обнаружили в составе тяжелой (Н) цепи ДОг человека последовательности, подобные (3-эндорфину и АКТГ (адре-нокортикотропному гормону, или кортикотропи-ну). Оказалось, что фрагмент 364—377 константной части Н-цепи ДО (ЗЬТСЬУКСРУРЗБ) имеет 40% подобия с антигенной детерминантой (З-эндор-фина (К8дТРЬУТЬРЮЧАЬК1Ч), а фрагмент 9-22 вариабельной части ДО (АЕУККРОБЗ-УКУБС) на 36% подобен фрагменту АКТГ 11-24 (КРУОКК1*КРУКУУР) (рис. 1). Ранее нами был синтезирован декапептид УККРвЗБУКУ, соответствующий аминокислотной последовательности 11-20 вариабельной части Н-цепи ДОЛ человека (авторское название пептида - иммунокортин, ИМК) [3]. Изучение рецепции и биологической активности ИМК показало, что пептид с высоким сродством связывается с рецепторами к АКТГ на синаптических мембранах головного мозга мыши
[3] и на различных типах иммунокомпетентных клеток человека и мыши и активирует аденилат-циклазу клеток-мишеней [4—8].
Однако действие ИМК исследовалось в основном в экспериментах in vitro, и практически не изучено его влияние на важные биохимические системы на уровне целого организма, т.е. в экспериментах in vivo. Известно, что АКТГ стимулирует синтез и секрецию глюкокортикоидов клетками пучковой и сетчатой зон коры надпочечников, внутриклеточным медиатором действия гормона является сАМР [9-11]. Поскольку ИМК с высоким сродством связывается с рецептором к АКТГ и повышает внутриклеточную концентрацию сАМР, представляет интерес исследование влияния этого пептида на уровень глюкокортикоидов в коре надпочечников и плазме крови лабораторных животных in vivo.
Настоящая работа посвящена изучению влияния ИМК на содержание 11-оксикортикостерои-дов (КС) в надпочечниках и плазме крови крыс in vivo, а также получению |251-меченого АКТГ-(11-24)-пептида и исследованию с его помощью связывания ИМК с мембранами коры надпочечников крыс in vitro.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Из коры надпочечников выделено и получено в кристаллической форме около 50 стероидов. Большинство из них - промежуточные продукты биосинтеза. В качестве основных гормонов, сек-ретируемых клетками коры надпочечников в кровь, следует рассматривать, по-видимому, только глюко-кортикоиды гидрокортизон (другое название -кортизол) и кортикостерон, а также минералкорти-коид альдостерон. Кортизон, 11-дезоксикортизол, преднизон и 11-дезоксикортикостерон также принадлежат к числу гормонов коры надпочечников, но уровень их секреции крайне низок. В кро-
1 10 20 30
ЗУЗМЕНРКМОКРУОККЕНРАЛКГОВШАЕОЕЗАЕАРРЬЕР
1 10 ■УККРСЗБУКУ
Рис. 1. Аминокислотные последовательности АКТГ человека и ИМК. Цифрами указаны номера аминокислотных остатков. Совпадающие остатки изображены жирным шрифтом. Последовательность АКТГ-(11—24) выделена заливкой.
ви человека, обезьян и морских свинок содержится в основном гидрокортизон, в крови грызунов (крыс, кроликов, мышей) кортикостерон резко преобладает над гидрокортизоном. Ни одно из перечисленных выше соединений не обладает значительной собственной флуоресценцией. Однако при обработке концентрированной серной или фосфорной кислотой кортикостероиды, имеющие ОН-группу в 11-м положении, кроме альдо-стерона, образуют флуоресцирующие производные [12]. Максимум спектра возбуждения этих производных лежит в области длин волн 470-475 нм, а максимум спектра флуоресценции - в области 520-530 нм. Кортикостерон и гидрокортизон образуют производные с максимумом спектра поглощения при 470 нм, тогда как производное кортизона, образованное в тех же условиях, не поглощает лучей с длиной волны более 410 нм. Использованный в настоящей работе метод Зенкера и Бернштейна [13] позволяет с достаточной степенью достоверности измерять общее содержание 11-оксикортикостероидов (КС) в различных тканях (кортикостерон, добавленный к плазме, определяется по этому методу на 90%).
Результаты, приведенные в таблице, показывают, что через 1 ч после введения ИМК в дозе 10 мкг/кг содержание КС в надпочечниках крыс снижалось в 2 раза, в плазме, напротив, этот показатель увеличивался примерно вдвое. Мы пред-
Влияние ИМК на уровень КС в плазме крови через 1 ч и в надпочечниках крыс через 1, 4 и 24 ч после внутримышечной инъекции
Доза ИМК, мкг/кг Уровень КС, опыт/контроль
через 1 ч через 4 ч через 24 ч
надпочечники плазма
10 0.53 ± 0.09 1.83 + 0.24 0.94 ± 0.23 0.38+0.02
р < 0.02 р < 0.02 р < 0.02 р < 0.001
100 0.93 ± 0.06 - 1.05 + 0.21 0.33 + 0.02
р< 0.001 р < 0.02 р <0.001
1000 1.61+0.19 2.24 + 0.19 1.07 ± 0.19 0.32 + 0.06
р < 0.02 р < 0.02 р < 0.02 р <0.001
* Контрольные и опытные группы содержали по 10 животных. Достоверность различий между контролем и опытом оценивали по ^-критерию Стьюдента.
352
НАВОЛОЦКАЯ и др.
Связывание, имп./мин
Время, мин
Рис. 2. Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (J) связывания 1251-меченого АКТГ-( 11-24)-пептида с мембранами коры надпочечников крысы от времени инкубации.
положили, что снижение содержания КС в надпочечниках в данном случае обусловлено повышением уровня секреции КС клетками коры под действием ИМК.
Как видно из таблицы, через 1 ч после инъекции в дозе 1000 мкг/кг ИМК вызывал повышение уровня КС в надпочечниках в 1.6 раза, а в дозе 100 мкг/кг практически не влиял на содержание КС. В то же время через 1 ч после введения ИМК в дозе 1000 мкг/кг наблюдалось увеличение содержания КС в плазме в 2.24 раза. Известно, что стимулирующим фактором стероидогенеза в клетках коры надпочечников является увеличение уровня с AMP [10]. Так как ИМК является активатором аденилатциклазы [3, 5, 6, 8], можно предположить, что наблюдаемое через 1 ч после введения большой дозы ИМК (1000 мкг/кг) возрастание уровня КС в надпочечниках обусловлено способностью пептида в этой дозе стимулировать синтез КС. Таким образом, по всей видимости, ИМК влияет не только на секрецию, но и на синтез КС.
Из таблицы следует, что через 4 ч после введения любой из трех доз ИМК содержание КС в надпочечниках не отличалось от контрольного, а через 24 ч снижалось в 3 раза. По нашему мнению, падение уровня КС в надпочечниках через 24 ч после введения ИМК свидетельствует о сложном системном действии пептида на организм. Механизмы, лежащие в основе такого действия, не известны. Однако, согласно нашим данным, ИМК связывается с рецепторами к АКТГ и вызывает значительное повышение уровня сАМР в клетках иммунной и нервной системы [3,5, 6, 8], поэтому можно предположить, что в их реализа-
ции, помимо эндокринной, участвуют также нервная и иммунная системы.
Ранее мы показали, что ИМК с высоким сродством связывается с рецепторами АКТГ на имму-нокомпетентных и лейкемических клетках человека и мыши, а также на синаптических мембранах головного мозга мыши [3-8]. Предположив, что действие ИМК на клетки коры надпочечников крысы также может быть опосредовано через рецепторы АКТГ, мы изучили рецепторную активность ИМК. Согласно данным Кап
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.