ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 4, с. 391-397
УДК 57.052;579.22
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА ИНДУЦИРУЕМЫЕ ГОМОСЕРИНЛАКТОНАМИ ПРОЯВЛЕНИЯ КВОРУМ СЕНСИНГА У БАКТЕРИЙ
© 2014 г. Д. Г. Дерябин*, А. А. Камаева*, А. А. Толмачева*, Г. И. Эль-Регистан**
*Оренбургский государственный университет, 460018, Оренбург **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, 117312, Москва e-mail: dgderyabin@yandex.ru Поступила в редакцию 16.09.2013 г.
Исследовано влияние 4 гомологов алкилоксибензолов (АОБ) с различной длиной углеводородной цепи на индуцируемый Сб-гомосеринлактоном (ГСЛ) синтез пигмента виолацеина и образование биопленки у Chromobacterium violaceum NCTC 13274, а также биолюминесценцию Escherichia coli pAL103, развивающуюся в присутствии Сб-оксо-ГСЛ. Установлено ингибирующее воздействие алкилоксибензолов на рост C. violaceum, увеличивающееся в ряду С5-АОБ ^ С^-АОБ при отсутствие данной активности у Ci-АОБ. Субингибиторные концентрации АОБ с различной интенсивностью снижали продукцию виолацеина и подавляли образование биопленки, что было представлено в виде индивидуальных и групповых регрессионных зависимостей между анализируемыми параметрами. С использованием биолюминесцентной модели показано, что регуляторные эффекты АОБ не связаны с их прямой конкуренцией с ГСЛ и развиваются в результате изменения чувствительности бактериальных клеток к действию соответствующего индуктора кворум сенсинга.
DOI: 10.7868/S0555109914040199
Малые молекулы играют важную роль во внутривидовой и межвидовой коммуникации у микроорганизмов [1]. Одним из ярких примеров является зависимое от плотности популяции коллективное поведение бактерий, называемое "кворум сенсингом" (quorum sensing, QS), реализуемое через биосинтез и восприятие различных гомосе-ринлактонов (ГСЛ) [2]. Первой из описанных и наиболее распространенной в мире прокариот является QS система LuxR/I типа, где ген luxI кодирует ГСЛ-синтазу, а luxR — воспринимающий ГСЛ рецепторный белок [3]. При этом общая последовательность событий включает накопление автоиндуктора в среде культивирования, его взаимодействие с рецепторным белком и связывание образующегося комплекса LuxR—ГСЛ с промоторами целевых генов [4]. Более чем у 450 бактериальных видов под подобным управлением находятся ферменты биолюминесценции [5], синтез пигментов [6] и антибиотиков [7], а также образование широкого спектра факторов вирулентности [8], что позволяет рассматривать систему кворум сенсинга в качестве мишени для создания новых средств подавления бактериальных инфекций [9].
Если система образования и узнавания ГСЛ способна оценивать минимальную плотность клеточной популяции, достаточную для экспрессии генов стационарной фазы, то другие малые молекулы контролируют максимально возможную численность клеток в культуре. В частности, подоб-
ный вид активности присущ особой группе феноль-ных липидов — алкилоксибензолам (АОБ) [10], обозначаемым в англоязычной литературе как резо-цинольные липиды или алкилрезорцины [11]. В отличие от ГСЛ, АОБ характеризуются мультитаргет-ным взаимодействием с мембранными структурами [12], белками [13] и нуклеиновыми кислотами [14], следствием чего является множественность их ре-гуляторных эффектов. При этом наиболее интегральным проявлением биологической активности АОБ при достижении максимально возможной численности клеток в культуре является остановка роста, а при дальнейшем повышении концентрации — образование гипометаболических и покоящихся форм [15]. Следствием описанного механизма является наличие у АОБ способности к ин-гибированию роста широкого круга патогенных и условно-патогенных бактерий [16], что позволяет предполагать возможность использования данной группы малых молекул для подавления бактериальных инфекций.
Исследование влияния АОБ на индуцируемые ГСЛ проявления коллективного поведения микроорганизмов имеет большое значение, так как создает перспективу для использования естественных механизмов межклеточной коммуникации для управлении системой кворум сенсинга бактериальных патогенов.
Цель работы — исследование влияния 4 гомологов АОБ с различной длиной углеводородной
(а) ГЛ
o^-nh^(ch2)4-ch3 o
(б) но
(ch2)-ch3
ho
Рис. 1. Структурные формулы ГСЛ (а) и АОБ (б), где п = 0, 4, 5 или 11; х — в составе С^-оксо-ГСЛ присутствует дополнительная оксогруппа; у — углеводородный радикал в молекуле С^-АОБ находится в 4 позиции.
цепи на индуцируемый С6-ГСЛ синтез пигмента виолацеина и образование биопленки Chromobac-terium violaceum NCTC 13274, а также биолюминесценцию Escherichia coli pAL103 в присутствии С6-оксо-ГСЛ.
МЕТОДИКА
В качестве малых регуляторных молекул, осуществляющих межклеточную коммуникацию у бактерий, использовали химические аналоги ГСЛ и АОБ со степенью очистки >99% (рис. 1). В качестве индукторов кворум сенсинга использовали N-гексаноил-Ь-гомосеринлактон (С6-ГСЛ) ("Cayman Chemical", США) и ^(оксо)-гексаноил-Ь-гомосеринлактон (С6-оксо-ГСЛ) ("Sigma", США). Гомологи АОБ: 1,3-диокси-5-метилбен-зол (С1-АОБ), 1,3-дигидрокси-5-пентилбензол (С5-АОБ) и 1,3-диокси-4-гексилбензол (С6-АОБ) — были получены от фирмы "Sigma" (США), а вновь синтезированный 1,3-диокси-5-додецил-бензол (С12-АОБ) — от фирмы "Enamine" (Украина).
Действие ГСЛ и АОБ исследовали на штамме C. violaceum NCTC 13274 ("Health Protection Agency", Великобритания) с инсерцией транспозона mini-Tn5 в ген cviI (аналог luxI), ответственный за синтез собственного автоиндуктора ^-ГСЛ [17] (табл. 1). В результате этот микроорганизм утратил способность к самостоятельному развитию QS-зависимых проявлений, но восстанавливал их при экзогенном внесении ГСЛ с длиной углеводородной цепи от С4 до С8 [18].
В качестве второго объекта воздействия использовали штамм E. coli pAL103; luxR+ luxIluxCDABE; Tetr p15A [19]. Характерная особенность штамма — наличие плазмиды pAL103, в составе которой — кассета luxCDABE генов, ответственных за развитие биолюминесценции, клонирована под контролем гена luxR, воспринимающего экзогенно вносимый C6-оксо-ГСЛ. Кроме
того, для повышения чувствительности данной репортерной системы, она была перенесена в хозяйский штамм E. coli JLD271 с мутацией в гене sdiA [20], продукт которого также распознает ГСЛ, и может конкурировать с белком LuxR за его связывание (табл. 1).
C. violaceum NCTC 13274 выращивали в LB-бу-льоне ("AppliChem GmbH", Германия) с добавлением глюкозы (10 мг/мл) при 27 ± 1°C. Полученную культуру суспендировали, после чего по 20 мкл переносили в стеклянные емкости с 1 мл LB-бульо-на, содержащего использованные гомологи АОБ в концентрациях от 4.5 до 1000 мкМ до включительно, а также 0.005 мкМ ^-ГСЛ, необходимого для индукции QS. В качестве отрицательного контроля использовали пробы без ГСЛ и АОБ, в качестве положительного — с ГСЛ без АОБ.
После 18—24 ч культивирования интенсивность роста оценивали, измеряя ОП450 на фотометре Stat Fax 303 6VIS "Awareness Technology Inc" (США). О развитии QS-зависимых реакций судили по образованию пигмента виолацеина, экстрагируемого 96%-ным этанолом из осажденной при 12000 g в течение 5 мин бактериальной биомассы и после повторного центрифугирования определяемого в супернатанте при длине волны 575 нм (ОП575) [21]. Депигментированный и высушенный на воздухе осадок использовали в тесте связывания красителя кристаллического фиолетового (КФ), который позволяет количественно охарактеризовать суммарную биомассу сформировавшейся биопленки [22]. Для этого к осадку добавляли 200 мкл 0.1 %-ного водного раствора КФ, после экспозиции в течение 45 мин несвя-завшийся краситель дважды отмывали дистиллированной водой, а прочно связавшийся КФ экстрагировали 200 мкл 96%-ного этанола и регистрировали при 540 нм (ОП540).
E. coli pAL103 культивировали в течение 24 ч при 37 ± 1°C на LB-агаре с 12 мкг/мл доксицик-лина, после чего исследование действия АОБ на развитие QS-зависимой биолюминесценции проводили в 2 вариантах эксперимента. В первом — культуру подращивали в LB-бульоне в течение 3 ч до достижения ОП450 = 0.5 ед. и по 100 мкл переносили в ячейки 96-луночного планшета из непрозрачного пластика "Microlite 2+" ("Thermo", США), содержащие по 100 мкл растворов исследуемых гомологов АОБ в концентрациях от 31.25 до 500 мкМ, а также C6-оксо-ГСЛ в концентрациях от 0.0125 и до 0.2 мкМ.
Во втором варианте культивирование E. coli pAL103 проводили в присутствии различных гомологов АОБ, учитывая конечное значение ОП450 в каждой пробе. Приготовленные таким образом культуры E. coli pAL103 в объеме 100 мкл переносили в ячейки 96-луночного планшета, содержащие индуцирующую дозу C6-оксо-ГСЛ. Планше-
Таблица 1. Бактериальные штаммы, использованные для оценки эффектов АОБ на QS-зависимые реакции бактерий
Штамм Особенности генетической конструкции Индуктор QS Репортерный признак Скорость развития реакции Источник
С. violaceum NCTC 13274 Инсерция транспозона штьТп5 в ген еуИ Q-ГСЛ Образование сине-фиолетового пигмента виолацеина 18-24 ч [6, 18]
E. coli pAL 103 Наличие кассеты генов 1ыхК+ 1ых1_1ыхСВАВЕ Q-оксо-ГСЛ Развитие биолюминесценции 15-60 мин [21]
ты помещали в термостатируемыи измерительный блок биолюминометра LM 01T ("Immunotech", Чехия), где в течение 60 мин динамически регистрировали свечение опытных и контрольных образцов, проводя оценку и архивирование полученных данных с использованием программного обеспечения KILIA. Степень индукции биолюминесценции определяли как отношение интенсивности свечения исследуемого образца на 60 мин к исходной точке, пересчитывая относительные значения светимости на количество биомассы, учитываемое по величине ОП450.
Все эксперименты выполнены не менее чем в 3 повторностях. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием компьютерных программ "Excel" и "Origin", численных и графических методов описательной статистики.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование влияния АОБ на индуцируемые ГСЛ проявления QS у бактерий было начато с анализа эффектов в отношении С. ую1аевыт МСТС 13274. При этом использование оптического метода регистрации при различных длинах волн (450, 540
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.