МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 640-652
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.151.03
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА ПРОЦЕССЫ ТЕРМОДЕНАТУРАЦИИ И РЕФОЛДИНГА БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ И СИНТЕЗ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА, ВЫЯВЛЕННЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ © 2014 г. Д. Г. Дерябин*, 1, И. В. Грязева*, О. К. Давыдова*, Г. И. Эль-Регистан**
*Оренбургский государственный университет **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 26.06.2013 г.
С использованием молекулярных и клеточных люминесцирующих тест-систем охарактеризовано действие пяти гомологов алкилоксибензолов (С7-, С9-, Сп-, Ci2-, С^-АОБ) на процессы термоденатурации бактериальной люциферазы и ее последующий рефолдинг, а также синтез белков теплового шока, выявлена зависимость эффектов АОБ от их структуры и концентрации. На примере хро-матографически очищенного препарата люциферазы/оксидоредуктазы Photobacterium leiognathii показана термопротекторная активность короткоцепочечных С7- и С9-АОБ в широком диапазоне концентраций (10—6—10—3 М), тогда как длинноцепочечные гомологи вызывали протекторный эффект только в микромолярных концентрациях, а в миллимолярных, напротив, увеличивали чувствительность белковых молекул к действию температурного фактора. С использованием рекомби-нантного штамма Escherichia coli К12 MG1655, конститутивно экспрессирующего luxAB-гены Vibrio fischeri, исследовано влияние АОБ на процессы внутриклеточного шаперон-независимого рефол-динга бактериальной люциферазы. Обнаружено восстановление функциональной активности тер-моинактивированного фермента при инкубации с микромолярными концентрациями короткоце-почечных АОБ, а длинноцепочечные гомологи во всем диапазоне исследованных концентраций препятствовали процессу рефолдинга. С использованием рекомбинантного люминесцирующего штамма Escherichia coli, несущего генетическую конструкцию ibpA '::luxCDABE, обнаружено влияние АОБ на синтез белков теплового шока (БТШ). В режиме прединкубации с бактериями длинноцепочечные АОБ дозозависимо активировали синтез БТШ (в 2.7—4 раза) с максимумом стимуляции при концентрации 10-4 М, что подтверждает их функции как "алармонов" (сигналов тревоги). При последующем температурном воздействии фактор индукции БТШ (F'¡) снижался в 5—15 раз (по сравнению с контролем, без прединкубации с АОБ) параллельно с увеличением численности оставшихся жизнеспособными клеток в 1.5—4 раза. Таким образом, предобработка клеток длинноцепочечны-ми АОБ обусловливает их предадаптацию к последующему стрессу. Короткоцепочечные АОБ в широком диапазоне концентраций вызывали подавление синтеза БТШ, сопровождающееся повышением терморезистентности обработанных ими бактериальных клеток.
Ключевые слова: алкилоксибензолы, термоденатурация белка, рефолдинг, белки теплового шока, ре-комбинантные тестерные штаммы, Escherichia coli, ген ibpA, lux-гены, биолюминесценция, люци-фераза.
DOI: 10.7868/S0026365614060044
Температура является одним из важнейших факторов, действующих в природных экосистемах и контролирующих многие стороны физиологии прокариот [1]. При температурах, выходящих за пределы толерантности для вида, у микроорганизмов развивается состояние стресса. В частности, стандартные события "теплового шока" включают нарушение третичной структуры
1 Автор для корреспонденции (e-mail: dgderyabin@yandex.ru).
ферментных белков, резкое понижение их каталитической активности, блокаду метаболических путей и, как следствие, остановку роста или гибель бактериальной клетки [2]. Указанные обстоятельства объясняют существование целого ряда эволюционно древних адаптивных систем, обеспечивающих устойчивость микроорганизмов к незапрограммированным в цикле их развития температурным стрессорным воздействиям различной интенсивности [3].
Важная роль в защите клетки от температурного фактора традиционно отводится обширной группе белков теплового шока (БТШ), неферментным белкам — молекулярным шаперонам и шаперонинам [4]. Основными эффектами БТШ являются предупреждение агрегации и восстановление нативной третичной структуры денатурированных белков, а в отсутствие температурного фактора — участие в фолдинге синтезируемых de novo белков, контроле их транслокации через цитоплазматическую мембрану и некоторых других процессах [5]. В частности, в клетках E. coli система молекулярных шаперонов включает белки IbpA и IbpB, первый из которых без стрессового воздействия температуры формирует систему внутриклеточных протофиламентов, блокируемую при взаимодействии с термоагрегированным субстратом или кошапероном IbpB [6].
Другой механизм терморезистентности связан со способностью бактерий синтезировать так называемые "химические шапероны" — низкомолекулярные соединения, образующие комплексы с биомакромолекулами за счет слабых (гидрофобных, ван-дер-ваальсовых, водородных) взаимодействий, неспецифических к структуре биополимера, стабилизирующие их пространственную структуру и способствующие рассеиванию энергии повреждения [7]. При этом, наряду с глицерином, бетаином, трегалозой и многоатомными спиртами, свойства химических шаперонов обнаруживаются у алкилоксибензолов (АОБ) — низкомолекулярных ауторегуляторных факторов бактерий и дрожжей, контролирующих их переход в гипометаболическое и анабиотическое (покоящееся) состояние с одновременным приобретением клетками высокой устойчивости к экстремальным воздействиям [8]. Документированные протекторные эффекты АОБ опосредуются как прямым взаимодействием с глобулой стабилизируемого белка [9], так и контролем экспрессии стрессовых регулонов [10].
Описанные результаты действия АОБ определяют интерес к выявлению целостной картины взаимоотношений между механизмами защиты белковых молекул от воздействия температурного фактора, в развитие которых потенциально вовлечены химические (АОБ) и молекулярные (IbpA) шапероны. Удобным инструментом для решения этой задачи представляются бактериальные лю-циферазы, каталитическая активность которых в системах in vitro и in vivo может быть прямо оценена по интенсивности развивающегося свечения (биолюминесценции) [11]. Создание на этой основе температуро-индуцируемых генетических конструкций [12] обеспечивает возможность биолюминесцентной оценки активности соответствующих стрессовых регулонов, тем самым позволяя сформировать более полное представление о механизмах биологического действия АОБ.
В этой связи целью настоящей работы было комплексное исследование влияния алкилоксибензолов на механизмы защиты бактерий от теплового стресса: процессы термоденатурации и последующего рефолдинга ферментных белков, а также синтез белков теплового шока, проведенное с использованием молекулярных и клеточных люминесцирующих тест-систем.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При проведении исследований использовали применяемые ранее химические аналоги АОБ микробного происхождения, представленные коммерчески доступными препаратами С7-АОБ, С1ГАОБ и С12-АОБ ("Sigma", США), а также синтезированными С9-АОБ и С18-АОБ ("Enamine", Украина) со степенью очистки 99.9% [13].
Для исследования эффектов АОБ на процессы термоденатурации, рефолдинга и синтез белков теплового шока были использованы следующие молекулярные и клеточные тест-системы (табл. 1).
Влияние АОБ на процессы термоденатурации ферментных белков оценивали с использованием "Комплекта реактивов для биолюминесцентного анализа" (Институт биофизики СО РАН), содержащего смесь хроматографически очищенных люциферазы и NAD(P)H : FMN-оксидоредукта-зы Photobacterium leiognathi [14]. В раствор люци-феразы/оксидоредуктазы вносили растворы исследуемых гомологов АОБ (100 мкл) до конечных концентраций 10—6—10—3 М, смесь выдерживали в течение 60 мин, после чего нагревали в твердотельном термостате "Термит" ("ДНК-Технология", Россия) в диапазоне температур от 30 до 44°C с шагом 2°С в течение 5 мин. В контрольных вариантах вместо АОБ в раствор ферментов вносили эквивалентный объем растворителей. Затем контрольные и опытные пробы переносили в кюветы, которые содержали смесь субстратов для реакции свечения, включающую 5.4 х 10-4 М фла-винмононуклеотида ("Sigma", США), 4 х 10-4 М восстановленного никотинамиддинуклеотида ("AppliChem", Германия) и 0.002% миристиново-го (С14) альдегида ("Merck", ФРГ) в 0.02 М фосфатном буфере (pH 6.8). Динамику свечения в опытной и контрольной пробах измеряли параллельно на двухканальном биолюминометре БЛМ 8802М2К (СКТБ "Наука", Россия). На основании полученных данных рассчитывали относительный индекс биолюминесценции по формуле
т /т-опыг т-контрч / / т-опыг т-контрч т-опыт т-опыт
/норм = (1° х 1о )/(!0 х !п ), где: 1о и1° -уровни свечения опытной пробы (ферменты в
присутствии АОБ) на нулевой и n-минуте; /0контр и
т-контр f-
1 ° - уровень свечения контрольной пробы (ферменты без АОБ) на нулевой и n-минуте.
Таблица 1. Молекулярные и клеточные люминесцирующие тест-системы, использованные для исследования белок-модифицирующей активности АОБ
Люминесцирующая тест-система Состав или генетические особенности Исследуемые процессы
Комплект реактивов аналитической биолюминесценции Смесь хроматографически очищенных ферментов: люциферазы и NAD(P)H : FMNB-оксидоредуктазы P. leiognathi, миристино-вый (С14) альдегид, флавинмононуклеотид, восстановленный ни-котинамиддинуклеотид Денатурация
Eschericia coli K12 MG1655 (pF2) [lux AB] Плазмида pF2 с встроенными luxAB-генами Vibrio fischeri, конститутивно транскрибируемыми под lac-промотором Шаперон независимый рефолдинг
Escherichia colipibpA' ::luxCDABE-AmpR Плазмида pibpA'::luxCDABE-AmpR с полной кассетой lux-генов Photorhabdus luminescence ZM 1, клонированных под индуцибель-ным промотором белка-шаперона IbpA Синтез белков теплового шока
Эффекты АОБ на процесс шаперон-независимо-го рефолдинга бактериальной люциферазы исследовали с использованием рекомбинантного штамма E. coli K12 MG1655, несущего гибридную плазмиду pF2 с конститутивно транскрибируемыми luxAB-генами Vibrio fischeri [15]. Бактерии выращивали при 28°С с принудительной аэрацией в течение 3 ч в колбах объемом 15 мл, со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.