ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ. 2000, том .12. М 3, с. 276-2НЗ
УДК 612,822./
ВЛИЯНИЕ АНАЛОГА ТЕТРАПЕПТИДА ХОЛЕЦИСТОКИНИНА НА ОПИОИДНУЮ РЕЦЕПЦИЮ В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО И ХРОНИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ МОРФИНА
© 2006 г. И. П. Анохина*, Т. В. Проскурякова*", Ж. Д. Беспалова**, М. Е. Палькеева**, В. А. Шохонона*. О. Б. Петриченко*
*ФГУ Национальный научный центр наркологин Росздрава, 119002. Москва. ГСП-2. М. Могильцевский пер.. 3; **ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗСР РФ. Москва Поступила в редакцию 20.09.2005 г. Принята к печати 19.12.2005 г.
Изучено влияние аналога тетранептида холецистокиннна (ССК-4) на опиондную рецепцию и уровень сАМР. Ti экспериментах in vitro аналог ССК-4 изменял связывание лигандов опиоидных рецепторов |i- и 5-типа. В экспериментах in vivo он обладал способностью предотвращать изменения они-оидной рецепции, вызванные однократным введением морфина или отменой морфина после его длительного введения. В состоянии интоксикации при длительном введении морфина действие аналога либо не проявлялось, либо аналог ССК-4 усиливал действие морфина. Аналог ССК-4, вводимый как отдельно, так и в сочетании с морфином, изменял форсколинстнмулированный уровень сАМР. Характер этих изменений зависел от структуры мозга и длительности введения морфина и аналога ССК-4.
Ключевые слова:холецистокинин-(30—33Уфрагмент (ССК-4); морфин; опиоидные рецепторы: сАМР.
ВВЕДЕНИЕ
Согласно современным представлениям, в формировании зависимости от опиатов существенную роль играет изменение опиатной рецепции и процессов десенситизации и интернализации рецепторов [ 11. В связи с этим в научной литературе обсуждается возможность поиска эффективных средств лечения опийной наркомании среди соединений. корригирующих опиатную рецепцию [2].
Физиологические эффекты как опиатов, так и эндогенных опиоидных пептидов проявляются в результате их взаимодействия со специфическими опиоидными рецепторами (ОР) Ц-. 5- и к-типа. широко представленными в центральной и периферической нервной системах [3], и регулируются большим числом нейромодуляторов, в том числе и биологически активными фрагментами холецистокиннна (ССК) - окта- и тетрапептидами ССК: ССК-8 (А$р-Туг-Ме1-С1у-Тгр-Ме1-А8р-Р11е) и ССК-4 (Тгр-Ме^Аяр-Рйе) [4|. ССК-8 взаимодействует в ЦНС с двумя типами рецепторов: ССК I -и СС,'К2-рецепторами, а ССК-4 обладает выражен-
Использованм стандартные сокращения, рекомендованные 1 комиссией IUPAC-IUB, а также: l?H]DAGO - PH. /í-Ala2, . yV-Me-Phe4. СЛу'-оЦэнксфалин; [ H|DADL - |3H. /í-Ala", D-Leir |эикефалин; F.GTA - (этилепдшжеи ¿днэтилендннит-ролотетрауксуспая кислота; OP-опиоидные рецепторы. й/1ля связи стел.: (495) 241-(12-43: эл. почта: pros-latyffimiu- 1 net.ru). i
ной селективностью к ССК2-рецепторам [5. 6|. Исследования показали, что ССК-8 и опиоидные пептиды обнаруживаются в одних и тех же морфологических структурах мозга, а их специфические рецепторы локализованы в непосредственной близости на цитоплазматической мембране нейронов [7, 8]. Стимуляция ССК2-рецепторов снижает анальгетическое действие морфина и эндогенных опиоидных пептидов [9]. тогда как антагонисты ССК2-рецегггоров усиливают индуцируемые опиоидами анальгезию [10] и антидепрес-сантноподобный эффект [11], а также обладают анксиолитической активностью [4].
Положительный клинический опыт применения лигандов ССК-рецеиторов для купирования тревожно-депрессивных расстройств, входящих в структуру опийной зависимости, инициировал целую серию исследований по разработке новых соединений, обладающих сродством к ССК-рецеп-торам.
Одно из таких соединений Тгр-Ме-^р-РИе-ЫНСН(СНя)2 (аналог ССК-4) было синтезировано нами [12]. Данная модификация сохраняла у аналога ССК-4 сродство к ССК-рецепторам, но при этом изменяла его селективность. Синтезированный пептид, помимо способности купировать состояние повышенной тревоги, при совместном введении с морфином предотвращал развитие то-
лерантности и зависимости, а при введении в период ремиссии подавлял влечение к морфину [ 13. 14].
Целью данного исследования было изучение механизма действия аналога ССК-4 при различных вариантах интоксикации морфином.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исходя из результатов исследования действия аналога ССК-4 в поведенческих тестах [13, 14), мы попытались выяснить, свойственно ли аналогу сродство к опиоидным рецепторам, для чего оценивали его действие на связывание лигандов, селективных к ц- и 5-ОР: рНШАСО и Г'НРАЭЬ соответственно.
Было установлено, что аналог ССК-4 при добавлении его в реакционную среду (см. "Эксперимент. часть") вызывал дозозависимое ингибнро-вание специфического связывания |Т! |ОАСЮ: максимальная степень ингибирования составила 74% при концентрации аналога 100 мкМ (рис. I, кривая /). В данном эксперименте в качестве мембранного препарата были использованы ткани стриатума, что связано с высокой плотностью, как (Х-, так и 8-ОР в этом отделе мозга 115]. Однако. согласно литературным данным, в нем представлены и ССК-рецепторы [16]. с которыми может взаимодействовать аналог ССК-4 112]. Если бы ц-ОР и ССК-рецепторы были локализованы в разных отделах мозга, то полученные нами результаты об ингибирования специфического связывания [ТПОАОО позволяли бы говорить о конкурентном взаимодействии аналога ССК-4 и меченого пептида за активный центр ОР. Но ОР и ССК-рецепторы. как известно, локализованы на одних и тех же нейронах и в непосредственной близости друг от друга [7, 8], и поэтому полученные результаты, на наш взгляд, не могут рассматриваться в качестве доказательства наличия у аналога ССК-4 сродства к ц-ОР.
При добавлении аналога ССК-4 в реакционную среду, содержащую высокоселективный аго-ннст 5-ОР [М-ПОАЭЬ. наблюдалось увеличение специфического связывания метки практически во всем диапазоне используемых концентраций. Максимальное специфическое связывание составило 165% (рис. I, кривая 2) при концентрации аналога 10 нМ, при этом за 100% принималось специфическое связывание метки в отсутствие аналога. Когда в присутствии аналога в этой концентрации определяли значения параметров связывания [3Н]бАОЦ то обнаружили, что количество связывающих участков значительно возросло: от 251 ± 27 в контроле до 763 ± 103 фмоль/мг белка, а их сродство к ['Н]ОАОЬ при этом достоверно не изменилось. Следовательно, можно предположить, что регистрируемое нами увеличение специфического связывания [•,Н]ОАОЬ в
Специфическое связывание, % 200 г
160 120 ХО 40 0
-10 -9 -8 -7 -6 lg(| Аналог|, VI)
-5 -4
Рис. I. Специфическое связывание атомистов ц- и 5-оииоидиых рецепторов— | 'H|DAGO (/) и | 'HIDADL (2) in vitro в присутствии аналога СС'К-4. */> < 0.05 — достоверность различий по сравнению с контролем (п = 5).
присутствии аналога ССК-4 происходит за счет возрастания числа связывающих участков, т.е. числа 8-ОР. Объяснить данный факт в экспериментах in vil го. вероятно, возможно только привлечением гипотезы о "неактивных" (фосфорили-рованных) рецепторах, которые при определенных условиях становятся активными и способными связывать собственные лиганды [ 1 ].
В экспериментах in vivo при однократном введении животным разных доз аналога было обнаружено, что параметры связывания ['HJDAGO ни в стриатуме. ни во фронтальной коре достоверно не изменялись при всех используемых дозах (табл. I). В то же время отмечалось достоверное уменьшение сродства и увеличение плотности мест связывания [3H]DADL во фронтальной коре и стриатуме. причем, в отличие от экспериментов in vitro (см. выше), с увеличением дозы аналога ССК-4 регистрировалось большее число мест связывания метки.
Для дальнейших экспериментов in vivo нами была выбрана минимальная доза аналога ССК-4 -
2 м кг/кг веса животного, так как уже при ней проявляется достоверный эффект данного пептида на опиоидную рецепцию. Более того, в предыдущих экспериментах нам удалось показать, что именно эта доза аналога значительно потенцировала анальгетическнй эффект морфина [12].
В табл. 2 представлены данные по влиянию аналога ССК-4 и морфина при однократном введении на параметры опиоидной рецепции. Можно видеть, что как при введении одного морфина, так и при сочетанном введении аналога и морфина наблюдалось падение сродства ['HJDAGO к рецепторам в обоих отделах мозга и тенденция к снижению плотности связывающих участков.
Таблица 1. Влияние аналога ССК-4 на связывающую активность опиоидных рецепторов при однократном введении животным
Доза аналога Стриатум Фронтальная кора
ССК-4. мкг/кг Kd, нМ йпшх, фмоль/мг белка Кй, нМ Й1ШХ. фмоль/мг белка
[3H|DAGO
(Контроль) 4.1 ± 1.2 448 ± 70 2.4 ±0.5 279±150
2 2.4 ± 0.2 323 ± 76 3.5 ± 1.8 197 ±33
20 5.4 + 0.8 484 ± 52 2.5 ±0.6 455 ±172
200 4.0 ±0.7 248 ±91 4.2 ± 1.0 274±161
|3H|DADL
(Контроль) 4.5 ± 1.2 292 ± 57 2.7 ± 0.8 61 ± 16
2 20.1 ± 4.5* 244 ± 60 7.9 ± 2.4* 465±I18*
20 21.9 ±2.4* 484 ± 20* 12.9 ±2.7* 878 ± 296*
200 20.1 ±2.5* 1210 dt 140* 8.0 ± 1.7* 1151 ±302*
*р< 0.005-достоверность различий но сравнению с контрольной группой животных; каждая группа состояла из 4-5 животных.
Таблица 2. Влияние аналога ССК-4'на связывающую активность опиоидных рецепторов при однократном вве-
дении морфина животным
Введенные Стриатум Фронтальная кора
вещества нМ йщах. фмоль/мт белка Кл, нМ Втш, фмоль/мг белка
[3H|DAC.O
(Контроль) 4.1 ± 1.2 448 ± 70 2.4 ±0.5 279 ± 18
Морфин 15.7 ±3.1** 393 ± 96 5.8 ± 1.2** 176 ± 61
Аналог* + морфин 10.2 ±2.0** 365 ±73 18.8 ± 2.9**- *** 255 ±51
|3H|DADL
(Контроль) 4.5 ± 1.2 292 ± 57 2.7 ± 0.8 61 ± 16
Морфин 7.7 ± 1.3** 285 ± 58 4.7 ±0.9 163 ±37**
Аналог* + морфин 9.7 ± 2.4** 189 ±38 4.1 ±0.8 50±10***
* Аналог (2 мкг/кг) вводили крысам за 15 мин до введения морфина. ** /> < 0.005 - достоверность различий по сравнению с контрольной группой животных. *** р < 0.005 - достоверность различий по сравнению с группой животных; получавших морфин; каждая группа состояла из 4-5 животных.
При исследовании связывания [3H]DADL после введения морфина также регистрировали падение его сродства к местам связывания, но при этом увеличивалась плотность рецепторов во фронтальной ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.