ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 5, с. 583-590
ФИЗИОЛОГИЯ животных И ЧЕЛОВЕКА
УДК 577.19:591.21
ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТА-р-(4-ГИДРОКСИ-3,5-ДИТРЕТБУТИЛФЕНИЛ)ПРОПИОНОВОЙ КИСЛОТЫ (ФЕНОЗАНА) НА РАЗВИТИЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
© 2007 г. В. Н. Ерохин, А. В. Кременцова, В. А. Семенов, Е. Б. Бурлакова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119991 Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: valery@sky.chph.ras.ru Поступила в редакцию 28.06.2006 г.
Изучено действие синтетического антиоксиданта Р-(4-гидрокси-3,5-дитретбутилфенил)пропионо-вой кислоты (фенозана) в различных дозах на развитие спонтанного лейкоза у мышей линии AKR. Эффективность препарата оценивалась по кривым выживаемости (смертности), продолжительности жизни животных и проценту возникновения лейкозов. Фенозан оказал отчетливое противоопухолевое действие в терапевтической (10-4 моль/кг, четырехкратное введение) и сверхмалой (10-14 моль/кг, четырехкратное введение) дозах. Доза 10-4 моль/кг наиболее эффективно увеличила продолжительность жизни короткоживущей части популяции, а доза 10-14 моль/кг увеличила продолжительность жизни долгоживущей субпопуляции. Препарат в ультранизкой дозе представляется перспективным для использования в профилактических целях.
В настоящее время большое значение приобретает вопрос о влиянии различных физико-химических факторов низкой интенсивности, в частности облучения, на живые организмы. Установлено, что их эффективность в малых и сверхмалых дозах сопоставима с эффективностью их действия в гораздо более высоких дозах, причем зависимость эффекта от дозы может носить сложный характер с несколькими экстремумами (Бурлакова, 1994; Бурлакова и др., 1996). Было показано, что радиация в малых дозах может оказать опасное влияние на живые организмы (Pierce, Preston, 2003-2004; Hooker et al., 2004; Prasad et al., 2004; Feinendegen, Neumann, 2005).
Как известно, одним из основных последствий влияния вредных экологических факторов (радиации, канцерогенов и т.д.) является увеличение риска онкологических заболеваний, частота которых в последнее время возросла (Анисимов, 2002; Яшин, Украинцева, 2004). Авторами было показано, что облучение мышей высокораковой линии AKR в возрасте 3-4 мес. гамма-излучением в дозе 1.2-2.4 сГр при мощности дозы 0.6 сГр в сут приводит к достоверному ускорению развития спонтанного лейкозного процесса, к уменьшению максимальной и средней продолжительности жизни (Бурлакова, Ерохин, 2001).
Проблема профилактики онкологических заболеваний, поиска препаратов, которые могли бы затормозить или полностью предотвратить развитие злокачественных новообразований, встает очень остро. В качестве возможного профилактического препарата нами был выбран ан-тиоксидант из класса экранированных фенолов
Р-(4-гидрокси-3,5-дитретбутилфенил)пропионовая кислота (фенозан). Этот антиоксидант был синтезирован в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН (Москва). Было показано, что он обладает противоопухолевым и радиозащитным действием (Старостина и др., 1985; Хохлов, Кириллов, 1988; Хохлов, Ярыгин, 1988; Молочкина, Озерова, 2003). В частности показано, что фенозан в терапевтической дозе тормозит развитие лейкоза у мышей линии AKR (Бурлакова, Ерохин, 2006).
Направление наших исследований хорошо согласуется с развиваемым в настоящее время подходом к профилактике раковых заболеваний с помощью эффективных малотоксичных веществ, к которым можно отнести и антиоксидан-ты (Won-Yoon Chang et al., 2001). Известно, что многие препараты в малых и сверхмалых дозах обладают активностью, сравнимой с активностью в терапевтических дозах (Бурлакова, 1994), но при этом обладают существенно меньшей токсичностью.
Целью данной работы было изучение влияния фенозана в малых и сверхмалых дозах на продолжительность жизни и развитие спонтанного лейкоза у мышей линии AKR.
Модель лейкоза линии AKR интересна тем, что у этих мышей в возрасте 6-11 мес в 65-95% возникает спонтанный лейкоз (Бландова и др. 1983). Следует отметить, что именно спонтанные лейкозы мышей по происхождению и клиническим проявлениям, по сходству морфологических особенностей наиболее близки лейкозам человека (Кассирский, 1964; Берггольц, Румянцев,
1966). Ранее нами было проведено подробное кинетическое исследование развития различных форм лейкоза мышей AKR (Ерохин, Бурлакова, 2003; Белич и др., 1972). Были получены кинетические кривые изменения гематологических показателей (общего количества лейкоцитов в 1 мкл крови, количества форменных элементов крови, за счет которых увеличивается количество лейкоцитов, числа недифференцированных (лейкозных) клеток), а также получены спектры ЯМР лимфоцитов, которые позволяют различить клетки, находящиеся на разных стадиях диф-ференцировки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы мыши линии AKR в возрасте 3-4 мес. Фенозан вводили в дозах 10-4 моль/кг и 10-14 моль/кг живого веса четыре раза подряд с интервалом в одни сутки, в физиологическом растворе объемом 0.2 мл/мышь. Поскольку доза фенозана 10-14 моль/кг является сверхмалой, параллельно в том же опыте был поставлен дополнительный контроль: животным вводили физиологический раствор по 0.2 мл 4 раза подряд с интервалом в одни сутки.
Фиксировалась продолжительность жизни (ПЖ) животных по известным датам их рождения и смерти. Посмертно, в течение суток после гибели, измерялась масса замещаемых лейкозными клетками органов: тимуса и селезенки. Наличие лейкоза у погибших животных диагностировалось по увеличенным размерам тимуса (более 50 мг) и селезенки (более 200 мг). Развитие лейкоза оценивали по ПЖ заболевших животных и частоте возникновения лейкоза в контрольных группах и группах, которым вводили фенозан. Экспериментальные группы состояли из 15-25 животных.
По данным о продолжительности жизни строились кривые выживаемости: доля доживших животных - возраст. Для количественной оценки воздействия препарата на развитие данного лейкоза была применена нелинейная аппроксимация кривых выживаемости функцией Гомпертца ^о-mpertz, 1825):
5 (^) = е( - ^ (^ -1 >),
где S(t) - доля доживших животных в возрасте £
у - параметры функции. Скорость процесса в основном определяется значением параметра у. Для нахождения численных значений этих параметров использовался метод наименьших квадратов Гаусса-Ньютона.
Для количественной оценки скорости развития лейкозного процесса и эффективности воздействия препарата нами рассчитывался модаль-
ный возраст (ттой) (Конрадов, Кутыркин, 1988) -возраст, при котором функция выживаемости имеет максимальный наклон (точка перегиба кривой выживаемости), а скорость вымирания популяции достигает максимума (моды):
Тшоё
1п у - 1п (к о ) У '
Поскольку мы ассоциируем параметр у со скоростью лейкозного процесса (Дронова и др., 1966), то чем меньше значения модального возраста, тем больше скорость развития процесса. Разность этих величин
д _ опыт контр
ЛТшоё = Тшоё — Тшоё
в контроле и опыте количественно характеризует эффективность воздействия.
Кроме этих параметров, по функции Гомпертца были рассчитаны средняя продолжительность жизни т и дисперсия а2 (Конрадов, Кутыркин, 1988):
т =
1п У - 1п (к о ) - Со 1
где С0 = 0.577 - константа Эйлера. Дисперсия распределения ПЖ равна:
2 1.64 а=
2
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для анализа полученных результатов кривая выживаемости условно была разделена на четыре части (квантили), соответствующие разным возрастным субпопуляциям, в частности, первая квантиль - короткоживущая субпопуляция, четвертая квантиль - долгоживущая субпопуляция. Данный подход позволил выявить особенности в действии фенозана при различных режимах введения на разные возрастные субпопуляции в популяции мышей линии AKR
На рис. 1а и в таблице приведены данные о влиянии на развитие лейкоза у мышей линии AKR фенозана в дозе 10-4 моль/кг. Представленные кривые выживаемости мышей в контроле и в опыте достоверно различаются друг с другом по критерию Колмогорова-Смирнова, с уровнем значимостир < 0.05. Наблюдается также увеличение средней продолжительности жизни (на 37 сут), модального возраста (Лтт^ = 29.9 сут).
Как видно из рис. 1а, препарат в дозе 10-4 моль/кг при четырехкратном введении в основном подействовал на коротко живущую часть популяции. Максимальная продолжительность жизни животных практически не возросла, т.е. наблюдалась рек-тангулизация кривых выживаемости. Дисперсия
уменьшилась по сравнению с контролем почти на 14% (таблица), т.е. фенозан уменьшил гетерогенность популяции по продолжительности жизни.
На рис. 16 представлены те же результаты, но в несколько ином виде. Период между временем гибели первого и последнего животного в группе был разделен на 4 части и подсчитано количество животных, погибших в каждом интервале. Для корректного сравнения контрольной и экспериментальной групп полученные результаты делили на количество животных в группе (это своего рода дискретный аналог плотности распределения ПЖ); эти величины отложены по оси ординат на рис. 16. Таким образом, были получены гистограммы, из которых отчетливо видно, что в различных интервалах возрастов скорость вымирания животных в опытной и контрольной группах различна. Причем наибольшие различия наблюдаются в первом возрастном интервале.
Был отмечен достоверный эффект (p < 0.05) действия фенозана в дозе 10-4 моль/кг и при однократном введении (средняя ПЖ увеличилась на 25.2 сут ).
Оказалось, что фенозан и в существенно меньшей дозе 10-14 моль/кг при четырехкратном введении (рис. 2а, таблица) оказал достоверное про-тиволейкозное действие. Фенозан при данном режиме введения не только увеличил среднюю ПЖ более чем на 40 сут и снизил процент возникновения лейкоза, но и увеличил максимальную ПЖ на 61 сут. Это говорит о том, что фенозан в данной дозе оказывал наибольшее влияние на долгожи-вущую часть субпопуляции. Модальный же возраст увеличился на 39.6 сут, что говорит о снижении скорости лейкозного процесса. Кривые выживаемости мышей, которым вводили физиологический раствор, достоверно не отличались от контрольных кривых (интактные животные) по критерию Колмолгорова-Смирнова.
Ги
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.