ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 3, с. 335-339
УДК 579.24+579.222
ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТА НА РОСТ И ОБРАЗОВАНИЕ ЛИПИДОВ У ГРИБА Lentinus tigrinus, РАСТУЩЕГО НА СРЕДЕ С ЛИГНОСУЛЬФОНАТОМ
© 2015 г. А. А. Ивашечкин*, Я. Э. Сергеева*, В. В. Лунин**, И. С. Мысякина*, Е. П. Феофилова*
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, 117312 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, Москва, 119991
e-mail: feofilov@inmi.host.ru, biolog100@bk.ru Поступила в редакцию 20.11.2014 г.
Добавление антиоксиданта (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин гидрохлорид) в культуру гриба Lentinus tigrinus, растущего на среде с лигносульфонатом, ингибировало рост и изменяло состав клеточных фосфолипидов. Изменялось также соотношение липидных мессенджеров, снижался уровень фосфатидной кислоты и резко увеличивалось содержание фосфатидилинозита. Замена в составе среды лигносульфоната на глюкозу и внесение антиоксиданта увеличивало выход биомассы L. tigrinus так же, как и у других грибов (Cunninghamella japonica), неспособных к биодеградации этого биополимера. Полученные данные свидетельствуют о специфичности ростовых процессов на лигносульфонате и подтверждают роль реакций свободнорадикального окисления в биодеградации этого биополимера L. tigrinus.
Ключевые слова: Lentinus tigrinus, лигносульфонат, антиоксиданты, свободнорадикальное окисление, фосфолипиды.
DOI: 10.7868/S0555109915030101
Лигнин является вторым по распространенности после целлюлозы природным соединением, имеющим ароматическую структуру и играющим важную роль в цикле углерода [1]. Палеохимиче-ские исследования позволяют заключить, что лигниноподобные соединения уже существовали в раннем геологическом периоде около 438— 42 млн лет назад. В растительных тканях лигнин сопутствует целлюлозе и гемицеллюлозе, но этот водонерастворимый биополимер отличается отсутствием стереорегулярности и не подвергается воздействию гидролитических ферментов [2].
По запасам лесных ресурсов Россия занимает ведущее место среди развитых промышленных стран. Покрытая лесами площадь территории России составляет 774.3 млн га (64.6%) [3]. Однако при разработке лесосек древесина используется только на 23%, что приводит к значительному накоплению отходов лесоперерабатывающей промышленности. В этих отходах основную часть биополимеров клеточных стенок растений составляют целлюлоза и лигнин. Но если на долю переработанной целлюлозы в целлюлознобумажной промышленности приходится около 2%, то лигнина перерабатывается в несколько раз меньше.
Лигнин, в отличие от целлюлозы, разлагается в природных условиях значительно медленнее, по-
этому в настоящее время он является одним из основных промышленных отходов. Скорейшая утилизация отходов и использование продуктов их переработки (например, фурфурола, гидролизного спирта, сахаров) возможны при создании экологически безопасных биотехнологических производств, в которых в качестве продуцентов могут быть использованы базидиомицетные грибы [2]. Эти грибы — возбудители белой гнили являются единственными организмами, способными в определенных условиях интенсивно разлагать лигноцеллюлозные субстраты. В процессе эволюции они сформировали модифицирующие лигнин метаболические системы, включающие внеклеточные ферменты и медиаторы, благодаря которым могут использовать трудно разлагаемые древесные остатки. Тем не менее, хотя продуценты известны уже около двух столетий, и имеются в большом количестве отходы деревообрабатывающей промышленности, работающие биотехнологические производства еще не созданы. Между тем, эффективная биопереработка лигнина может обеспечить такие виды производства, как животноводство, растениеводство, получение биодизеля.
В настоящее время известно, что в мицелии грибов активные формы кислорода играют роль сигнальных молекул, регулирующих физиологи-
336
ИВАШЕЧКИН и др.
ческие ответы в ходе роста и развития [4]. В настоящее время большой интерес вызывает гипотеза, появившаяся еще в 70 годы прошлого столетия, о том, что в разрушении древесины мицелиальными грибами значительная роль принадлежит экстра-целлюлярным активным формам кислорода, которые принимают участие в деградации лигноцел-люлозы [5, 6]. Предполагают также, что воздействие на субстрат свободнорадикального окисления (СРО) должно быть первоначальным, в дальнейшем в процессе могут принимать участие активные ферменты типа лакказ, в результате чего и происходит разрушение лигнина. В атаке на полимерный лигнин особое значение придают гидроксильным радикалам (*ОН), пероксил-ра-дикалам (ROO*) и оксипероксил-радикалам (* ООН). В пользу значительной роли СРО в разложении лигнина грибами свидетельствует также интенсификация этого процесса воздухом или кислородом [7].
Было высказано предположение, что проверить участие СРО в деградации лигнина грибами можно ингибируя генерацию свободных радикалов путем введения антиоксидантов (АО), так как известно, что имеются два пути гашения СРО: ферментный, с помощью супероксиддисмутазы (СОД) и с помощью АО [4]. Вероятно, присутствие АО должно повлиять на рост гриба, так как затруднит потребление лигнина, что должно отразиться на выходе биомассы.
Цель работы — исследование действия АО на рост лигнинразрушающих грибов.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. В качестве основного объекта исследования был выбран базидиальный гриб Lentinus tigrinus BKM F-160. Для сравнения использовали штамм мукорового гриба Cunnin-gamella japónica BKM F-1204. Штаммы грибов получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института физиологии и биохимии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.
Культивирование на жидких питательных средах. Lentinus tigrinus BKM F-160 в контрольном варианте опыта выращивали на питательной среде с глюкозой (5%) и нитратом аммония, как описано ранее [7]. В опытных вариантах глюкозу заменяли на лигносульфонат натрия (ЛСН, 2%), взятый в эквивалентном количестве по углероду. Кроме того, в ряде опытов для ускорения роста мицелия (интенсификации ростовых процессов и индукции лигнолитических ферментов) к ЛСН дополнительно вносили "затравку" — 0.5% глюкозы. Глубинное культивирование осуществляли на круговой качалке (250 об./мин) в колбах емкостью 250 мл с 50 мл питательной среды при температуре 27°С в течение 8 сут.
В качестве антиоксиданта применяли 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридин гидрохлорид, который в концентрации 2 х 10-4 М вносили в 48-часовую культуру гриба L. tigrinus. Продолжительность культивирования — 7 сут.
Исследование качественного и количественного состава индивидуальных фракций липидов. Экстракцию липидов из влажной биомассы проводили по методу Фолча, количество определяли гравиметрически [8, 9]. Состав фракций нейтральных липидов (НЛ) и полярных липидов (ПЛ) анализировали методом восходящей тонкослойной хроматографии (ТСХ) [9, 10] на пластинках с закрепленным слоем силикагеля марки "Merck" (Германия). Для разделения НЛ использовали системы растворителей: гексан—диэтиловый эфир—уксусная кислота (85 : 15 : 1) или петро-лейный эфир—диэтиловый эфир—уксусная кислота (80 : 20 : 2). Для разделения ПЛ использовали двумерную ТСХ: последовательно использовав в одном направлении систему хлороформ—метанол—вода (65 : 25 : 4), во втором: хлороформ-ацетон- метанол-уксусная кислота-вода (50 : 20 : 10 : : 10 : 5). На пластинку ("Merck", Германия) наносили 70-120 мкг липидов.
Идентификация липидных фракций. Идентификацию фракций проводили с использованием стандартных препаратов липидов, а также по специфическим качественным реакциям на отдельные функциональные группы. С этой целью использовали: реактив Драгендорфа, раствор нин-гидрина, раствор а-нафтола, смесь серной и уксусной кислот. В качестве универсального проявителя использовали 10%-ный раствор фосфор-номолибденовой кислоты в этаноле.
После идентификации липидных фракций для определения их количественного содержания проводили денситометрический анализ с использованием программ "Dens" и "Sorbfil" (Россия). В качестве стандартов для построения калибровочных кривых использовали стандартные растворы фосфатидилхолина (ФХ), триацилгли-церинов (ТАГ) и свободных жирных кислот (СЖК) ("Sigma", США).
Обработка результатов проводилась с использованием метода медианы, а также пакетов программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc.) и Microsoft Office Excel 2003, 2007.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При внесении АО в среду с ЛСН, который присутствовал в качестве единственного источника углерода в среде для выращивания L. tigrinus, происходило ингибирование роста гриба почти на 50% (рис. 1, 2). Как было показано ранее [7] и подтверждено в настоящем исследовании, добавление глюкозы в качестве "затравки"
ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТА НА РОСТ И ОБРАЗОВАНИЕ ЛИПИДОВ
337
3.5 3.0 ^2.5
1-е
S 2.0
о
й 1 с
53 1.5
о S
W 1.0 0.5
0
50 г 2
40 -
а 30 -
н 20
о
10
Рис. 1. Влияние АО на рост и накопление биомассы гриба Ь. tigrinus при культивировании на средах с ЛСН: 1 - ЛСН 2%; 2 - ЛСН 2% + 2 х 10-4 М АО; 3 -ЛСН 2% + 0.5% глюкозы; 4- ЛСН 2% + 0.5% глюкозы + 2 х 10-4 М АО.
к среде с ЛСН приводило к значительной интенсификации ростовых процессов, выход биомассы увеличивался (рис. 1, 3).
Добавление в среду АО оказывало также влияние и на выход липидов, при этом их количество уменьшалось. Как отмечалось ранее, рост гриба Ь. tigrinus в присутствии ЛСН сопровождался значительными изменениями в составе фосфолипи-дов (ФЛ) [7]. Основным отличием от контрольного варианта на глюкозе было резкое повышение уровня фосфатидной кислоты (ФК), превышающего уровень фосфатидилэтаноламина (ФЭА) и фосфатидилхолина (ФХ) почти в 2 раза, и низкое содержание фосфатидилинозитола (ФИ) [7]. Введение АО изменяло состав ФЛ - содержание ФК несколько уменьшалось, уровень ФЭА оставался практически без изменений, но почти вдвое уменьшалось содержание ФХ на фоне значительного увеличения ФИ (рис. 2).
Известно, что при изменении внешних условий в передаче клеточных сигналов у грибов принимают участие, в основном, два мессенджера -ФК и инозитол-4,5-дифосфат, образующийся из ФИ. Наблюдаемые изменения в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.