НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 4, с. 318-326
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821.2+612.829.3
ВЛИЯНИЕ АНТИОРТОСТАТИЧЕСКОЙ ГИПОДИНАМИИ И ПЕРЕГРУЗКИ НА ДИСКРИМИНАНТНОЕ ОБУЧЕНИЕ И ОБМЕН МОНОАМИНОВ
В СТРУКТУРАХ МОЗГА МЫШЕЙ © 2012 г. А. С. Штемберг1, В. С. Кудрин2, П. М. Клодт2, В. Б. Наркевич2, А. С. Базян3, *
Учреждение Российской академии наук Государственный научный центр РФ-Институт медико-биологических проблем РАН 2Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт фармакологии
им. В.В. Закусова РАМН
3Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Исследовали влияние моделей невесомости (АнОГ) и перегрузки (АнОГ + ЦФ) на дискриминант-ное обучение мышей и концентрацию моноаминов и их метаболитов в некоторых структурах мозга. Экспериментальные воздействия приводили к определенному ускорению формирования двигательного поведенческого стереотипа, лежащего в основе дискриминантного пищевого обучения. Это происходило на фоне более слабой пищевой мотивации экспериментальных животных, по сравнению с контрольными животными. Вероятно, этот эффект можно отнести на счет так называемого "сужения внимания". Это происходит за счет подавления исполнительных механизмов двигательной и ориентировочно-исследовательской активности, снижающего афферентную генерализацию. Исследования концентрации моноаминов и их метаболитов в префронтальной коре, гипоталамусе, стриатуме и мозжечке выявили значительную интенсификацию метаболизма серотонина, в отличие от катехоламинов. Поведенческие результаты обсуждаются с позиции возникновения эмоционально-отрицательного состояния, связанного с активностью серотонинерги-ческой системы префронтальной коры ("принятие решения", направленное на избавление от отрицательного состояния) и реализации целенаправленного поведения и ("выбор действия" в виде получения награды — пищи), реализуемое нейронными сетями стриатума и мозжечка. Такая реакция возможна и на фоне слабой пищевой мотивации.
За почти 40-летний период исследований влияния факторов космического полета на организм экспериментальных животных в наземных и полетных экспериментах были достаточно детально изучены изменения в различных системах организма: костная, мышечная, вестибулярная, сердечно-сосудистая системы, водно-солевой обмен, процессы эмбриогенеза, роста и развития млекопитающих и другие, происходящие под влиянием факторов космического полета, основным из которых является невесомость.
Наибольшее количество вопросов остается в области исследования механизмов интегратив-ных функций основной регуляторной системы организма — центральной нервной системы (ЦНС) в процессе космического полета. Основное внимание уделялось изучению центральной регуляции вестибулярной системы: так, в экспериментах на обезьянах было показано, что невесомость оказывает влияние на чувствительность нейронов медиального вестибулярного ядра к воздействию угловых и линейных ускорений. Исследованию же интегративных функций ЦНС
* Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, 5А, e-mail: bazyan@mail.ru.
уделялось недостаточно внимания. Исследования нейрохимических механизмов, участвующих в интегративных функциях ЦНС, практически не проводилось.
Основная цель работы — изучение возможных нарушений выработанного поведения, вызванных воздействием невесомости и перегрузок в наземных экспериментах, моделирующих воздействие этих факторов, их нейрохимических механизмов, а также исследование уровня стресса, вызванного экспериментальными воздействиями, измеряемого по изменениям концентрации катехоламинов и их метаболитов в плазме крови (предполетные исследования).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводились на 45 самцах мышей линии С57В1/6 массой 20—25 г. Животные были размещены в виварии по пять в клетке, при естественных условиях освещения (день приблизительно 8 ч), со свободным доступом воды и пищи. Правила работы с животными и протоколы экспериментов утверждены этическими комиссиями Учреждения Российской академии наук Института высшей нервной деятельности и нейрофи-
зиологии РАН и Учреждения Российской академии наук Государственного научного центра РФ — Института медико-биологических проблем РАН.
Моделирование невесомости и перегрузки. Экспериментальные животные были подвергнуты воздействию 30-суточной антиортостатической гиподинамии (АнОГ), которая является принятой экспериментальной наземной моделью невесомости для мелких лабораторных животных [1, 2]. При создании АнОГ использовали индивидуальные секции из оргстекла. Животных вывешивали за основание хвоста с помощью специальной втулки под углом 30°—40° с расчетом снятия статической нагрузки с задних конечностей. При этом мышей крепили с помощью специальных карабинов, надевающихся на металлический стержень, так, чтобы они могли свободно перемещаться в пределах клетки. Таким образом, создавался антиортостаз, вызывающий перераспределение жидкостей в организме, и снималась статическая нагрузка с задних конечностей.
В опытах использовали следующие экспериментальные группы: интактный (виварийный) контроль (К), группа животных, подвергнутых воздействию АнОГ (АнОГ) и группа животных, после снятия с АнОГ, подвергнутых однократному вращению на центрифуге (АнОГ + ЦФ).
Вращение на центрифуге АСЕА проводилось до достижения перегрузки 8 g на протяжении 10 мин с градиентом нарастания и снижения перегрузки 0.4 g/с. Вращение проводили по группам в клетках (по 5 мышей в каждой), что соответствовало условиям полетного эксперимента.
Дискриминантное обучение. У контрольных и подвергнутых экспериментальным воздействиям мышей вырабатывали дифференцировочный дви-гательно-пищевой условный рефлекс (УР) по методике, предложенной Г.А. Григорьяном [3]. В каждой экспериментальной группе было по шесть животных.
Методика обучения заключалась в следующем. В изолированной и практически свободной от дополнительных раздражителей камере размером 50 х 45 х 35 см помещали два комплекта из чашек (диаметр 2.7 см) и теннисных шариков черного и белого цветов, накрывающих эти чашки. Подкреплением служил вкусный корм (маленькие кусочки шоколада массой 25—50 мг), который обладал сильным возбудительным эффектом. Предварительно животных подвергали суточной пищевой депривации. Чтобы уравнять возможные эффекты обучения, связанные с запахом шоколада, на дно каждой чашки помещали куски шоколада, в десятки раз превышающие разовую порцию подкрепления. Их прикрывали аккуратно вырезанной по диаметру дна чашки картонкой так, чтобы они были скрыты и недоступны для мышей. Подкрепление помещали на наружную часть картонки, при-
крывая его теннисными шариками, размещенными в чашках.
При предварительном обучении вначале мышей помещали в экспериментальную камеру, в которой были сняты шарики, прикрывающие чашки с подкреплением. После обнаружения подкрепления и выработки у животных целенаправленных побежек к чашкам их прикрывали шариками. Мыши достаточно быстро обучались сталкивать носом шарики и получать подкрепление. После трех успешных проб предварительное обучение считали завершенным.
Процедура основного обучения состояла в следующем. Две одинаковые чашки, накрытые шариками черного и белого цветов размещали в экспериментальной камере на расстоянии 10 см друг от друга. Подкрепление помещали только в чашку, накрытую черным шариком. Пространственное расположение чашек в камере меняли от пробы к пробе в случайном порядке. Обучение проводили за одну серию предъявлений — по 15 проб в серии. Интервал между пробами составлял 30 с. Правильной реакцией считали сброс черного шарика и получение подкрепления, ошибочной — сброс белого шарика и неполучение подкрепления.
В процессе обучения регистрировали следующие показатели: число правильных и ошибочных реакций выбора, латентный период условного рефлекса (ЛП УР), а также количество видоспеци-фических стереотипных поведенческих реакций в процессе обучения: груминговых реакций, вертикальной двигательной активности и пассивно-оборонительных реакций ("реакций замирания" — "freezing"). Полученные данные обрабатывали с помощью критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни.
Хроматографическое определение моноаминов. Контрольных и подвергнутых экспериментальным воздействиям мышей декапитировали, отбирали у них 200—300 мкл крови, выделяли соответствующие структуры мозга, замораживали в жидком азоте и взвешивали. Кровь отбирали во флакон, содержащий 10 мкл 5% ЭДТА и 5 мкл 10% метабисульфита натрия. Плазму крови получали центрифугированием в течение 5 мин (3000 об/мин) и замораживали в жидком азоте. При подготовке к хроматографическому разделению в пробирку на 5 мл вносили 100—200 мкл плазмы и добавляли 50 мкл 0.5 нмоль/мл внутреннего стандарта ДГБА (3,4-дигидроксибензиламина). В стандартную пробу вносили 50 мкл смеси определяемых соединений (по 0.5 нмоль/мл каждого) в 2 мл фосфатного буфера. Добавляли 500 мкл 1.5 М трис-буфера рН = 8.6, 25 мг адсорбента (активированного Al2O3 - БИОХРОМ, Москва). Пробы встряхивали на вибромиксере 30 с, затем 10 мин на горизонтальном встряхивателе. Центрифугировали на центрифуге (ОПн-8) при 2000 об/мин. в течение 3 мин, надосадочную жидкость удаляли па-
m «
и
Я M ce <D
р
Й
3 «
л
4
и
m й
р
G
О
ч о
и
F
350 300 250 200 150 100 50
0
— Контроль 1 -АнОГ 1 ■ АнОГ + ЦФ
4
* А
\1 i
*
I■
*
-à—Щ—Ь А А "й—O-L-Л
M *
j_I_I_1_
_|_I_I И I
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Число предъявлений
Рис. 1. Среднее число правильных реакций мышей после воздействия АнОГ и перегрузки (АнОГ + ЦФ) по отношению к контролю, принятому за 100%.
*р <0.05 — достоверные различия между экспериментальными группами; хр < 0.05 — достоверные различия с контролем.
стеровской пипеткой и отбрасывали. Осадок адсорбента дважды промывали пипеткой по 2 мл бидистиллированной воды, встряхивая по 1 мин, каждый раз удаляя воду досуха, затем центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3 мин, и тщательно удаляли промывную воду. Для десорбции (выделения) катехоламинов к промытому адсорбенту добавляли 100 мкл 0.2 М HClO4, встряхивали на вибромиксере 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.