ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 5, с. 367-374
^=ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 593.3 612.6.03
ВЛИЯНИЕ АРАХИДОНОИЛДОФАМИНА, ГАЛОПЕРИДОЛА И ИХ СМЕСЕЙ НА РЕГЕНЕРАЦИЮ ПРЕСНОВОДНОЙ ГИДРЫ
Hydra attenuata1
© 2004 г. Л. Н. Маркова, Т. В. Остроумова*, В. В. Безуглов**, Г. А. Бузников
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119991 Москва, ГСП-1, ул. Вавилова, д. 26 *Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 119992 Москва, ГСП, Ленинские горы **Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 117871 Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10 E-mail: marlidus@yahoo.com Поступила в редакцию15.10.03 г. Окончательный вариант получен 15.03.04 г.
Арахидоноилдофамин и галоперидол как в отдельности, так и в смеси в различных сочетаниях тормозят регенерацию гастрального и базального отделов гидры. Кроме того, оба вещества вызывают устойчивые аномалии морфогенеза в виде выростов и дополнительных щупалец у гастральных регенератов. В смеси этих двух веществ в различных концентрациях аномалии или не возникают, или существуют кратковременно, что говорит о нормализации процесса морфогенеза. Обсуждаются возможные механизмы действия этих веществ.
Ключевые слова: гидра, регенерация, морфогенез, арахидоноилдофамин, галоперидол.
Гидра является широко используемой моделью биологии развития и, в частности, служит для изучения процессов регенерации и морфогенеза. Имея довольно простой план строения, она обладает исключительной способностью к регенерации.
Гидра - один из самых примитивных организмов, имеющих истинные нейроны, образующие нервную сеть с ганглиоподобными структурами в головном отделе и в области подошвы. Нервная система гидры, обладая большой функциональной пластичностью, является одним из важнейших регуляторов плана строения и морфогенеза, в том числе и при регенерации (Koizumi et al., 1988; Shaller et al., 1996).
Данные о нейротрансмиттерах кишечнополостных, и в частности гидры, накапливались медленно и часто были противоречивы. Основными трансмиттерами кишечнополостных в настоящее время принято считать нейропептиды (Grimme-likhuijzen et al., 1992). Что же касается классических нейротрансмиттеров (ацетилхолина, дофамина, серотонина), то сведения об их присутствии у кишечнополостных немногочисленны и разноречивы, что, вероятно, объясняется вариабильнос-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 02-04-48129).
тью физиологического состояния этих животных (Ми11ег й а1., 1993; БИаИег й а1., 1996). Тем не менее в ряде работ приводятся данные о присутствии классических трансмиттеров или отдельных компонентов их систем у кишечнополостных, и в том числе у гидры (Ье^ е! а1., 1963; УеШийш е! а1., 1984; Са1Ъег§, 1992; МсСаи1еу, 1997). Совсем недавно идентифицированы гены, кодирующие никотиновые ацетилхолиновые рецепторы. Показано, что один из генов экспрессируется во время роста почки и при регенерации головы в эктодер-мальных клетках зачатков щупалец, но не в нервных клетках (Шго8е е! а1., 2003). Эти результаты показывают не только наличие холинергической системы у гидры, но и ее участие в морфогенезе головы.
Используя иммунохимический и гистофлуо-ресцентный методы, мы обнаружили в активных ростовых и функциональных областях гидры (область почки, подошвы, субгипостомальная) тиро-зингидроксилазу - ключевой фермент синтеза дофамина, а также флуоресценцию, специфическую для катехоламинов (Маркова, Остроумова, 1995). Известно, что нейротрансмиттеры помимо своей основной функции синаптических передатчиков являются регуляторами самых разнообразных процессов и, в частности, морфогенеза (В^шкоу, 1990; В^шкоу е! а1., 2001). Недавно на-
И
Рис. 1. Схема разреза гидры, отделы: 1 - апикальный,
2 - гастральный, 3 - базальный.
ми было установлено, что блокатор дофаминовых рецепторов галоперидол тормозит регенерацию и вызывает аномалии морфогенеза гаст-рального отдела H. attenuata (Остроумова, Маркова, 2000). Мы предположили, что возникновение этих аномалий может быть связано с нарушением функций эндогенного дофамина. Внесение экзогенного дофамина могло бы снимать или ослаблять эти нарушения. Поскольку дофамин в инкубационной среде нестабилен, для проверки своего предположения мы использовали его устойчивый липофильный аналог - арахидо-ноилдофамин (АА-ДА).
Ранее на других объектах было показано, что биологически активные амиды полиеновых жирных кислот (а эти соединения могут рассматриваться как своеобразные химические гибриды первичных и вторичных мессенджеров) и, в частности, арахидоновой кислоты с серотонином и дофамином оказывают четко выраженное защитное действие против антагонистов соответствующих аминов (Бузников, Безуглов, 2000). Так, АА-ДА ослаблял или предотвращал цитотокси-ческое действие галоперидола у ранних зародышей различных групп морских беспозвоночных. АА-ДА обладает большей липофильностью, чем дофамин, лучше проникает через клеточную мембрану и является более стабильным в инкубационной среде. Помимо этого изучение его действия представляет самостоятельный интерес, поскольку недавно было показано присутствие этого соединения в нервной ткани млекопитающих (Huang et al., 2002). Кроме того установлено, что арахидоновая кислота является активным морфо-геном: внесенная извне, она вызывает появление аномалий у гидры в виде эктопических щупалец и дополнительных голов. Наличие эндогенной арахидоновой кислоты у гидры позволяет считать,
что она играет, по-видимому, важную роль в морфогенезе животного (Muller et al., 1993).
Цель данной работы - выявление эффектов АА-ДА - вещества, сочетающего в себе фрагменты арахидоновой кислоты и дофамина, в сравнении с действием антагониста дофамина - гало-перидола на процесс регенерации гидры.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работу проводили на культуре пресноводной гидры Hydra attenuata. Животных содержали в искусственной среде. Кормление проводили через день личинками Artemia (Lenhoff, 1982). В экспериментах использовали животных без почек через сутки после кормления. Гидру разрезали на три фрагмента - апикальный, гастральный и базальный (рис. 1). Так как основные морфогенети-ческие события разворачиваются при регенерации гастрального и базального участков, основное внимание уделяли именно этим отделам. Пять соответствующих регенератов инкубировали в 2 мл среды при температуре 18-20°С. Каждый вариант опыта повторяли три-пять раз, в зависимости от воспроизводимости результатов. Контролем служили регенераты, не обработанные веществами и находящиеся в тех же условиях содержания.
Галоперидол ("Sigma", США) использовали в качестве блокатора D1- и Б2-рецепторов дофамина. АА-ДА был синтезирован в Лаборатории ок-силипинов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Безуглов и др., 1997). Вещества растворяли в ди-метилсульфоксиде (ДМСО) (галоперидол) или спирте (АА-ДА). Промежуточные разведения готовили на среде инкубации. Используемые при разведениях концентрации спирта или ДМСО сами по себе не вызывали никаких аномалий.
Вначале было изучено действие каждого из веществ в отдельности в различных концентрациях. Подбор концентраций проводили по схеме, отработанной ранее (Остроумова, Маркова, 2000), и далее использовали концентрации, не вызывающие гибель или повреждения регенератов. Всего были поставлены три группы опытов: действие галоперидола (25, 10 и 5 мкМ), действие АА-ДА (10, 5 и 2.5 мкМ), действие смесей галоперидола и АА-ДА.
Галоперидол, мкМ 25 25 10 10 10 АА-ДА, мкМ 25 10 10 5 2.5
Соотношение 1 : 1 2.5 : 1 1 : 1 2 : 1 4 : 1
Наблюдения за регенерацией фрагментов вели ежедневно в течение 5-6 сут в зависимости от длительности процесса регенерации. Действие веществ оценивали по следующим параметрам: время появления зачатков щупалец в гастраль-
Рис. 2. Зависимость скорости регенерации гастрального (□) и базального (■) отделов гидры от концентрации веществ, мкМ:
а - контроль; б-г - галоперидол (б - 25, в - 10, г - 5); д-ж - АА-ДА(д - 10, е - 5, ж - 2.5); з-л - смесь галоперидрола и АА-ДА соответственно (з - 25 + 10, и - 10 + 10, к - 10 + 5, л - 10 + 2.5).
По оси абсцисс - продолжительность инкубации, сут; по оси ординат - регенераты с щупальцами, %.
120 100 80 60 40 20 0
1 2 3 4 5
100 80 60 40 20 0
120 100 80 60 40 20 0
120 100 80 60 40 20 0
120 100 80 60 40 20 0
120 100 80 60 40 20 0
120 100 80 60 40 20 0
1 2
1
3 4 5
д
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3
120 100 80 60 40 20 0
1 2 3 4 5 6 7
120 100 80 60 40 20 0
J_III il И 11
1 2 3 4 5 6 7
120 100 80 60 40 20 0
1 2 3 4 5 6
120 100 80 60 40 20 0
1 2 3 4 5 6
120 100 80 60 40 20 0
_i_I_и
1 2 3 4 5 6 7
ном и базальном отделах (скорость регенерации); наличие аномалий морфогенеза (отношение числа атипичных регенератов к общему числу животных). Достоверность различий определяли по /■-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Скорость регенерации
Скорость регенерации, оцененная по времени появления щупалец в гастральном и базальном отделах, представлена на рис. 2. В контроле зачатки щупалец у гастральных регенератов в 80% случаев появляются на 2-е сут после операции. В это время лишь 17% базальных регенератов
имеют щупальца. На 3-й сут щупальца есть у 100% гастральных и 90% базальных регенератов, а на 4-е - все 100% регенератов обоих отделов имеют щупальца (рис. 2, а). Таким образом, скорость регенерации гастрального отдела у контрольных животных всегда опережает скорость регенерации базального отдела.
Действие галоперидола. При действии галоперидола (25 мкМ) (рис. 2, б) происходит задержка регенерации: на 2-е сут зачатки щупалец отсутствуют как у гастральных, так и у базальных регенератов. На 3-и сут лишь 20% гастральных регенератов имеют зачатки щупалец, у базальных они по-прежнему отсутствуют. На 4-5-е сут количество регенератов с щупальцами увеличивается,
Рис. 3 Аномалии морфогенеза гастрального отдела гидры при действии: 5 мкМ АА-ДА (а); 10 мкМ гало-перидола (•); смеси галоперидола (10 мкМ) и АА-ДА (2.5 мкМ) (в).
при этом скорость регенерации базального отдела значительно ниже, чем гастрального, как в опыте, так и у контрольных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.