АГРОХИМИЯ, 2013, № 7, с. 56-61
УДК 579.873:581.132
ВЛИЯНИЕ АССОЦИАТИВНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ НА ПРОРОСТКИ ПШЕНИЦЫ ПРИ ОСМОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
© 2013 г. И.Г. Широких1' 2, С.Ю. Огородникова2, А.А. Широких1
Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого РАСХН 610007 Киров, ул. Ленина, 166 а, Россия E-mail: irgenal@mail.ru 2Институт биологии Коми научного центра УрО РАН 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28, Россия
Поступила в редакцию 15.02.2013 г.
Исследовали влияние филлосферных штаммов МеЛу1оЪа^епит та^оШетат .ГСМ 283 ШБР и М. ехШщиет АМ1 ВКМ В-2064вБР на проростки мягкой пшеницы (ТгШсит aestivum Ь.) в водной культуре при нормальном и избыточном осмотическом давлении. Колонизация семян метилобактериями приводила к их стабильной ассоциации с растениями. При стрессе оба штамма оказали на растения протекторное действие, о чем свидетельствовали более низкое, по сравнению с контролем без инокуляции, содержание в листьях малонового диальдегида, отсутствие существенных изменений в комплексе фотосинтетических пигментов, большее накопление проростками сухой массы.
Ключевые слова: ассоциативные метилотрофные бактерии, проростки пшеницы, осмотический стресс.
ВВЕДЕНИЕ
Глобальное изменение климата в последние десятилетия, а также хозяйственная деятельность человека привели к тому, что одним из самых распространенных явлений, оказывающих на растения неблагоприятное воздействие, стал дефицит влаги, который наблюдается не только в условиях засухи, но и при засолении почвенных и водных ресурсов, загрязнении их нефтью и нефтепродуктами. Повышение способности растений переносить недостаточную обеспеченность водой имеет решающее значение для сельскохозяйственного производства во всем мире.
Перспективным направлением управления продуктивностью сельскохозяйственных культур, а также повышения их жизнестойкости и выносливости при различных стрессах является использование ассоциативных и симбиотических микроорганизмов. Сообщалось, что инокуляция ризосферы растений цитокинин-продуцирующи-ми микроорганизмами увеличивала содержание в них цитокининов и снижала степень ростингиби-рующего действия засухи [1, 2]. Для повышения засухоустойчивости полевых культур рекомендован биопестицид альбит, который содержит очи-
щенные метаболиты почвенных бактерий Bacillus megaterium и Pseudomonas aureofaciens.
В последнее десятилетие в качестве фитосим-бионтов внимание исследователей привлекли аэробные метилотрофные бактерии [3]. Способность ассоциативных метилотрофных бактерий к синтезу фитогормонов и витаминов, других биологически активных веществ обусловила практический интерес к использованию этой группы бактерий для разработки новых биотехнологий микроразмножения и регенерации гнотобиотиче-ских растений in vitro [4-6], в том числе трансгенных [7], а также создания бактериального препарата - стимулятора роста растений. Однако в литературе практически отсутствуют сведения о способности ассоциативных метилотрофных бактерий оказывать влияние на растение при стрессе.
При недостатке влаги жизненно важными для растений являются окислительные повреждения [8], в том числе перекисное окисление липи-дов (ПОЛ) мембран. Существенным моментом в адаптации растений к условиям осмотического стресса является развитие систем, предотвращающих образование активных форм кислорода (АФК) [9], а также функциональная и структур-
ная перестройка их фотосинтетического аппарата [10].
Цель работы - анализ влияния двух филло-сферных штаммов метилобактерий на рост, содержание в листьях пластидных пигментов, анто-цианов и перекисное окисление липидов в тканях колонизированных ими проростков пшеницы, выращенных при нормальном и избыточном осмотическом давлении.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы филлосферные штаммы Methylobacterium radiotolerans JCM 2831 GFP и M. extorquens AMI ВКМ B-2064 GFP, полученные из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пу-щино. Для выращивания бактерий использовали жидкофазное культивирование на минеральной среде Канеда с метанолом, содержащей (г/л): KH2PO4 - 2, (NH4)S04 - 2, MgSO4 • 7H2O - 0.125, NaCl - 0.5, FeSO4 • 7H2O - 0.002, дрожжевой ав-толизат - 0.1. Метанол в количестве 1% (об. : об.) добавляли в среду после стерилизации. Культивирование микроорганизмов проводили при 27°С на качалке (180 об/мин) в течение 2 сут.
Влияние микроорганизмов на растения, подвергнутые осмотическому стрессу, изучали в вегетационных опытах с использованием камеры искусственного климата фирмы "ILKA" (Германия). Растения выращивали в водной культуре при освещенности 10 Клк, фотопериоде 16 ч, температуре 23/18°С день/ночь в течение 14 сут, проводили аэрирование питательного раствора. Семена яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Приокская стерилизовали в 2%-ном растворе препарата виркон С в течение 15 мин и замачивали для инокуляции в жидких культурах бактерий M. extorquens (2.1*107 КОЕ/мл) и M. radiotolerans (9.1 х 106 КОЕ/мл) на 24 ч. Контролем служили семена, замоченные в питательной среде, на которой выращивали бактериальные культуры. После замачивания семена проращивали в рулонах фильтровальной бумаги в течение 3 сут. Затем колеоптили проростков обертывали губкой и помещали в перфорации пластиковых сосудов, заполненных раствором Кнопа в половинной концентрации. Для создания избыточного осмотического давления в раствор добавляли 10%-ный полиэтиленгликоль (ПЭГ) с относительной молекулярной массой 6000. Варианты опыта: 1) контроль без инокуляции при нормальном осмотическом давлении; 2) контроль без инокуляции при повышенном осмотическом давлении (10%-ный
ПЭГ); 3) инокуляция M. extorquens при нормальном осмотическом давлении; 4) инокуляция M. radiotolerans при нормальном осмотическом давлении; 5) инокуляция M. extorquens + 10%-ный ПЭГ; 6) инокуляция M. radiotolerans + 10%-ный ПЭГ. В каждом варианте выращивали по 24 растения.
Колонизацию тканей проростков пшеницы исследованными штаммами определяли с помощью вариантов, маркированных геном gfp (зеленого флуоресцирующего белка) [11]. Тестирование растительных тканей на присутствие метилобак-терий осуществляли на давленых препаратах под люминесцентным микроскопом фирмы "Leica DM2000" (Германия) при увеличении х900.
У проростков в возрасте 14 сут определяли морфометрические и биохимические показатели. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в средних пробах корней и листьев анализировали по цветной реакции тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом (МДА), образующимся в процессе ПОЛ [12]. Содержание фотосинтетических пигментов определяли на спектрофотометре "Specol" (Германия) в ацетоновой вытяжке [13] при длинах волн 662, 644 (хло-рофиллы) и 440.5 нм (каротиноиды). Антоцианы экстрагировали из листьев 1%-ным раствором соляной кислоты. Количественное определение антоцианов проводили в соответствии с методикой [14] при 510 и 657 нм.
Полученные данные обработаны стандартными статистическими методами с использованием пакета программ Excel. В таблицах приведены средние величины по 2-м отдельным экспериментам в 3-х биологических повторениях и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Интегральной характеристикой, отражающей степень адаптации к изменениям окружающей среды, является рост растения. Поскольку в условиях водного дефицита у растений быстро развивается защитная реакция, заключающаяся в торможении клеточного деления и растяжения [15], добавление в питательный раствор осмотика привело в первую очередь к замедлению темпов линейного роста проростков пшеницы. Масса проростков существенно не изменилась, в то время как линейные размеры в присутствии ПЭГ достоверно снизились (табл. 1).
Чувствительность к водному дефициту листьев оказалась больше, чем корней. Длина про-
ростка пшеницы без инокуляции снизилась в присутствии ПЭГ на 40%, длина корня - только на 20%, в результате чего соотношение длины проросток : корень изменилось от 1.7 до 1.2, т. е. в пользу корня.
Изменение соотношения линейных размеров побега и корня - важная стрессовая реакция растений. Перераспределение длины в пользу корней может являться следствием накопления абс-цизовой кислоты (АБК) и снижения содержания цитокининов. Данное предположение основано на том, что АБК тормозит рост побега в большей степени, чем корней, а цитокинины нужны для роста побега, но ингибируют этот процесс в корнях [16, 17].
Совсем иную картину наблюдали в результате инокуляции пшеницы культурами метилотрофных бактерий: соотношение длины проросток : корень у инокулированных проростков практически не уменьшилось в присутствии осмотика (табл. 1). Сухая масса инокулированных проростков пшеницы, выращенных в условиях дефицита влаги, достоверно превышала сухую массу неинокули-рованных растений, а также растений, не подвергнутых воздействию осмотика.
Особенно значительно способствовала увеличению биомассы при стрессе (в 1.5 раза по сравнению с растениями в нормальных условиях) инокуляция культурой М. radiotolerans 1СМ 2831 вБР. В отличие от М. ел^щиет АМ1, М. radiotolerans 1СМ 2831 содержит 1-аминоцикло-пропан-1-карбоксилатдезаминазу (АЦК-деамина-зу) [18] - фермент, снижающий в растениях уровень стрессового гормона - этилена, биосинтез которого активируется в стрессовых условиях (в том числе при осмотическом стрессе). Благодаря бактериальной АЦК-деаминазе содержание этилена в растительных тканях проростков могло снижаться [19], что и стимулировало ростовые процессы. Эти результаты указывали на необходимость более детального изучения взаимодействия растений с бактериями, содержащими АЦК-деаминазу, а также роли этого фермента в устойчивости растений к водному дефициту.
Микроскопия листовых и корневых тканей растений, подвергнутых инокуляции метилобак-териями, маркированными геном ^'р, выявила стойкую флуоресценцию, указывающую на заселение штаммами М. radiotolerans 1СМ 2831 вБР и М. ел^^иет АМ1 ВКМ В-2064 вБР растений пшеницы с образованием устойчивых микробно-растительных ассоциаций. Установление факта колонизации метилотрофными бактериями к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.