ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 1, с. 89-98
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:581.143.5
влияние ассоциативных псевдомонад и метилобактерии на рост и устойчивость растении к фитопатогенам
и ксенобиотикам
© 2012 г. Н. С. Захарченко*, С. В. Пиголева*, В. В. Кочетков**, М. А. Чепурнова***, О. В. Дьяченко*, А. А. Лебедева*, А. В. Захарченко*, И. Ф. Пунтус**, А. М. Воронин****, Я. И. Бурьянов*
*Филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино, Московская обл. **Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл. ***Тульский государственный университет, Тула ****Пущинский государственный университет, Пущино, Московская обл. Поступила в редакцию 27.02.2011 г.
Исследовано взаимодействие растений табака (Nicotiana tabacum L.), томата (Lycopersicon esculentum Mill.), капусты (Brassica oleracea var. capitata L.), рапса (B. napus L.) и хрустальной травки (Mesembry-anthemum crystallinum) с бактериями Pseudomonas aureofaciens, P. putida и Methylovorus mays in vitro и in vivo. Показана стабильная ассоциация этих микроорганизмов с растениями. Колонизированные растения отличались ускоренным ростом, лучшим укоренением, адаптацией к условиям in vivo и повышенной устойчивостью к бактериальным и грибным фитопатогенам Erwinia carotovora, Sclerotinia sclerotiorum и Phytophthora infestans. Растения, колонизированные бактериями с устойчивостью к ка-намицину и нафталину, проявляли стабильный рост на среде с этими соединениями. Полученные результаты указывают на перспективность использования полезных ассоциативных микроорганизмов для разработки методов защиты растений от биотических и абиотических стрессовых факторов.
Ключевые слова: высшие растения — ассоциативные микроорганизмы — фитопатогены — колонизация
ВВЕДЕНИЕ
Повышение устойчивости растений к различным стрессовым факторам является одной из важных задач современной физиологии растений и основой повышения эффективности сельскохозяйственного производства. Кроме прямой селекции и применения химических средств, защита растений от фитопатогенов может быть достигнута применением генно-инженерных технологий [1] и использованием микробиологических средств [2]. С учетом биологической безопасности, применение последней стратегии при ее совершенствовании представляется наиболее перспективной. В природных условиях растения существуют в тесной ассоциации с комплексом почвенных микроорганизмов, которые оказывают стимулирующее влияние на рост и развитие растений
Сокращения: КОЕ — колониеобразующая единица; Кт — ка-намицин.
Адрес для корреспонденции: Захарченко Наталья Сергеевна. 142290 Московская обл., Пущино, Проспект Науки, 6. Филиал Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Электронная почта: 2аеИаг@ fibkh.serpukhov.su
[3, 4]. Это связано со способностью микроорганизмов к азотфиксации, продуцированию физиологически активных веществ, мобилизации питательных элементов из почвы, подавлению роста фитопатогенов и детоксикации чужеродных химических соединений. Список микроорганизмов, положительно влияющих на рост растений и их устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, невелик и расширение этого списка является перспективной научно-исследовательской задачей.
Наша работа посвящена исследованию влияния колонизации растений ассоциативными псевдомонадами и метилобактериями на рост и устойчивость растений к некоторым биотическим и абиотическим стрессовым факторам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектами исследования служили: томат (Lycopersicon esculentum Mill.) сорта Джина, капуста белокочанная (Brassica oleracea var. capitata L.) сорта Слава 1305, рапс (Brassica napus L.) сорта Галант, хрустальная трав-
ка (Mesembryanthemum crystallinum) и табак (Nic-otiana tabacum L.) сорта Самсун.
Семена стерилизовали 1.5 мин в 70% этаноле, затем 2 мин в 20% растворе гипохлорита натрия и промывали 3 раза (по 10 мин) в стерильной дистиллированной воде. Семена проращивали на безгормональной среде Мурасиге—Скуга (МС) [5] первые 5 дней в темноте, далее — на свету при 24°С и 16-часовом фотопериоде. Через 3 нед. со стерильных растений срезали верхушки размером 5—7 мм, которые переносили для пролиферации побегов на среду следующего состава: макросоли, микросоли и витамины — по прописи среды МС; для капусты, рапса и томата дополнительно вносили регуляторы роста: 0.5 мг/л БАП и 0.02 мг/л ИУК. Проростки черенковали 1 раз в месяц.
Штаммы бактерий и условия их культивирования. Для колонизации растений использовали: ризосферные псевдомонады Pseudomonas aureo-fatiens BS1393, P. putida BS590 [6], P. putida КТ 2442::gfp [7] и метилобактерии Methylovorus mays ВКМ В-2221 (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН) [8]. Псевдомонады выращивали до D660 = 1.0 при 28°С на роторной качалке (120 об./мин) в 750 мл колбах Эрленмейера, содержавших 200 мл среды LB [9], включающей бактотриптон ("Difco", США) — 10 г/л, дрожжевой экстракт ("Difco") — 5 г/л, NaCl — 10 г/л. Выращивание метилобактерий проводили до D600 = 1.5 при 37°С на роторной качалке (120 об./мин) в 750 мл колбах Эрленмейера, содержавших 200 мл среды К [8], включающей (г/л): KH2PO4 — 2.0; (NH4)2S04 - 2.0; NaCl - 0.5; MgSO4 • 7Н2О -0.125; FeSO4 - 0.002; агар - 12.0 ("Difco"), с добавлением 1% СН3ОН в качестве источника углерода и энергии. В качестве фитопатогенных штаммов использовали бактерии Erwinia carotovo-ra subsp. сагоШуога B15 (Horticulture СеПхе, Канада) и грибы Sclerotinia sclerotiorum (ВНИИ масличных культур им. В.С. Пустовойта, Краснодар) и Phytophthora infestans (МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва).
Перенос плазмид в клетки M. mays. Перенос плазмиды Bin19 [10] в клетки метилобактерий проводили методом электропорации. Условия электропорации: 1.8 кВ, 25 мФ, 200 Ом, зазор ячейки 1 мм, время импульса 3.9-4.6 мс. Трансформанты M. mays ВКМ В-2221 (pBin19) отбирали на среде К, содержавшей 1% метанола и 50 мг/л кана-мицина (Кт), и анализировали с помощью электрофореза в 0.8% агарозном геле.
Колонизация растений ассоциативными бактериями. Семена и молодые побеги томата, капусты, рапса, хрустальной травки и табака обрабатывали суспензией псевдомонад или метилобак-терий. Для этого семена помещали в жидкую культуру бактерий с титром 103—105 на 1-2 мин, подсушивали на фильтровальной бумаге и пере-
носили на чашки Петри, содержавшие питательную среду МС. Молодые побеги однократно опрыскивали 1 мл суспензии бактерий с титром 103—105 и культивировали в стеклянных пробирках. В качестве контроля на среду МС помещали необработанный бактериями растительный материал и культивировали при 22—24°С, 16-часовом фотопериоде и освещенности 2 клк. Колонизированные и укорененные растения in vitvo переносили в закрытый грунт (станция искусственного климата Биотрон).
Тестирование растений на стабильность ассоциаций. Тестирование растительных тканей на присутствие ассоциативных бактерий и определение количества бактерий на колонизированных растениях проводили по стандартным методикам [8]. Анализ проводили через две—три недели после черенкования. Для этого из различных эксплан-тов (корни, стебли, листья) получали растительный экстракт путем гомогенизации растительной ткани. Экстракт наносили на поверхность твердой питательной среды LB и К в чашках Петри и инкубировали при температуре 22—24°С двое суток. Затем проводили подсчет колониеобразую-щих единиц на 1 см2 площади растительной ткани. Исследование колонизации растений бактериями, маркированных геном зеленого флуоресцентного белка (gfp), проводили с помощью флуоресцентной микроскопии.
Биотесты на изолированных листьях и растениях. Для проверки устойчивости колонизированных растений к фитопатогенам молодые листья инфицировали суспензией бактерий E. carotovom или заражали кусочками мицелия грибов S. sclero-tiorum и P. infestans. В качестве контроля служили листья неколонизированных растений. Фитопато-генными бактериями (суспензия 103—105 клеток/мл) и грибами инокулировали черешки листьев колонизированных и неколонизированных растений, помещали их на агаризованную питательную среду МС в чашки Петри, выдерживали их в закрытом состоянии их при 24°С и 16-часовом световом дне и через 1—14 суток (в зависимости от вида патогена) оценивали степень повреждения. Целые растения заражали посредством укола иглой, смоченной в суспензии патогенных бактерий. Для заражения грибными патогенами кусочек агара с мицелием помещали на центральную жилку листа.
Фитопатологическое обследование посадок растений в контролируемых условиях закрытого и открытого грунта проводили в два срока за вегетацию, учитывая появление и распространение заболевания. Степень развития болезни отмечали на последнем сроке учета. Для определения интенсивности развития болезни и степени поражения листьев и плодов растений использовали
\ К
Ж
условные шкалы [11, 12]. В каждом варианте опыта заражали по 4 листа.
В таблицах представлены средние арифметические величины и их стандартные отклонения 3—5 опытов по 3 биологические повторности в каждом (n = 9—15).
Устойчивость колонизированных растений к нафталину. Нафталин растворяли в спирте (што-ковый раствор — 100 мг/мл). В расплавленную агаризованную среду МС добавляли растворенный в спирте нафталин до концентрации 1 и 0.1 мг/мл. В подготовленные пробирки со средой пересаживали свежечеренкованные растения и наблюдали за ростом растений в течение месяца.
Адаптация растений к условиям in vivo. Корни отмывали водой от остатков среды МС и высаживали растения в горшки объемом 5 л, заполненные почвенной смесью торф : песок (1 : 1). Горшки с растениями накрывали полиэтиленовой пленкой, создавая условия повышенной влажности. Полив производили водопроводной водой. Для оптимального режима питания растений их обеспечивали сбалансированным комплексным удобрением, включающим азот, фосфор и калий; для этого гранулы удобрений смешивали с почвенной смесью (12 г гранул на 5 л смеси). Условия адаптации: о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.