БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2007, том 33, № 6, с. 624-628
УДК 577.29:612.01.46
ВЛИЯНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТРИТЕРПЕНОВ - БЕТУЛИНА И ГЛИЦИРРЕТОВОЙ КИСЛОТЫ НА РОСТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК MT-4, MOLT-4, CEM И Hep G2
© 2007 г. Ä. Б. Шинтяпина*#, Э. Э. Шульц**, Н. И. Петренко**, Н. В. Узенкова**, Г. Ä. Толстиков**, Н. В. Пронкина***, В. С. Кожевников***, Ä. Г. Покровский*
*ФГУН государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", 630559, п. Колъцово, Новосибирская обл.; **Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск; ***Новосибирский институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск Поступила в редакцию 15.09.2006 г. Принята к печати 19.02.2007 г.
Получены производные доступных растительных тритерпенов - глицирретовой кислоты и бетули-на (сукцинаты бетулина, амиды бетулоновой и 18ß-глицирретовой кислоты, содержащие фрагменты длинноцепочечных аминокислот и пептида) и исследовано ингибирование ими роста опухолевых клеток линий MT-4, MOLT-4, CEM и Hep G2 и влияние на апоптоз этих клеток. Показано, что амиды бетулоновой кислоты являются более активными ингибиторами роста опухолевых клеток, чем соответствующие амиды глицирретовой кислоты. Кроме того, амиды бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты каприловой, пеларгоновой и ундекановой кислот, являются более активными ингибиторами роста опухолевых клеток, чем бетулиновая кислота. Наибольшей ингибирующей активностью в исследуемых опухолевых клетках обладает 17-дипептидопроизводное бетулоновой кислоты - Ж-{Ж-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенилпропионовая кислота. Методом проточной цитометрии получены данные по индукции апоптоза в опухолевых клетках производными бетулина в концентрации 10 мкг/мл. Наиболее активными индукторами апоптоза явились амиды бетулоновой кислоты.
Ключевые слова: тритерпеноиды; бетулиновая кислота; глицирретовая кислота; опухолевые клеточные линии; апоптоз.
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы возрастает интерес к изучению противоопухолевой активности растительных тритерпеноидов. Согласно работе [1], выявлено более 100 представителей соединений этого класса, перспективных в качестве антинеопластических агентов. Особое внимание привлекают к себе такие соединения, как лупановый тритерпен бетулин (I) и тритерпеноид олеананового ряда - 18ß-глицирре-товая кислота (II), доступные для получения из растительных источников (коры березы и корня солодки, соответственно) и обладающие весьма ценной и разнообразной биологической активностью.
Бетулин (I) и получаемая из него бетулиновая кислота (III) обладают комплексом ценных фармакологических свойств - противовоспалительных, ранозаживляющих, гепатопротекторных, противовирусных и противоопухолевых [2, 3]. В настоящее время бетулиновая кислота (III) проходит доклинические исследования в США в качестве средства для лечения и профилактики злокачественной ме-
# Автор для связи (тел.: (383) 336-74-60; факс: (383) 336-6011; эл. почта: shintyapina_ab@mail.ru).
ланомы. Показано, что бетулиновая кислота ин-гибирует рост опухолевых клеток, вызывая апоптоз в клетках меланомы in vitro и in vivo [4, 5]. Подобный эффект наблюдается при действии бе-тулиновой кислоты на нейроэктодермальные и эпителиальные опухолевые клетки, механизм которого связан с протеолитической активацией каскада каспаз в этих клетках [6, 7]. По данным работ [3, 8-10], простые модификации бетулино-вой кислоты (^-амиды бетулиновой кислоты с глицином и аланином, ^-альдегид бетулоновой кислоты) приводят к получению фармакологически важных производных, представляющих интерес в качестве противоопухолевых агентов. 3,28-Ди-О-ацильные производные (диметилсук-цинаты) бетулина оказались активными анти-ВИЧ-агентами [11].
Все более широкое применение находят препараты на основе глицирретовой кислоты. Так, ди-натриевая соль кислого сукцината 18в-глициррето-вой кислоты, применявшаяся для лечения язвенной болезни, оказалась перспективной в качестве анти-ВИЧ-агента и проявляла антимутагенный эффект на моделях мутагенеза, вызванных бензпиреном,
ВЛИЯНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ТРИТЕРПЕНОВ
2-аминофлуореном, афлатоксином В [12]. Для 18ß-глицирретовой кислоты в комбинации с глюкокор-тикоидами обнаружен синергетический антипроли-феративный эффект в экспериментах in vitro [3, 13].
Цель настоящей работы - исследование воздействия некоторых сукцинатов бетулина, а также амидов и пептидов бетулоновой и глицирретовой кислот, содержащих фрагменты длинноцепочеч-ных аминокислот, на рост клеток опухолевых клеточных линий MT-4, MOLT-4, CEM, Hep G2, а также влияния сукцинатов бетулина (Ia), (I6), бетули-новой (III) и бетулоновой (IV) кислот, амидов
625
бетулоновой кислоты (IVa)-(IVr) на уровень апо-птоза в этих клетках.
В работе изучали следующие тритерпеноиды: бетулин (I), его дисукцинат (Ia) и моносукцинат 3-ацетата бетулина (I6), амиды глицирретовой кислоты с аминокислотами (IIa)-(IIe) и дипептид (Пж), a также бетулиновую кислоту (III), бетулоно-вую кислоту (IV), ее амиды с аминокислотами (IVa)-(IVß) и дипептид (IVr). Синтез и физико-химические характеристики соединений описаны в работах [14, 15].
Производные бетулина (I).
R
22
R3
(I) R1 = OH, R2 = H, R3 = CH2OH;
(Ia) R1 = OC(O)(CH2)2CO2H, R2 = H, R3 = CH2OC(O)(CH2)2CO2H; (I6) R1 = OAc, R2 = H, R3 = CH2OC(O)(CH2)2CO2H;
(III) R1 = OH, R2 = H, R3 = CO2H;
(IV) R1 + R2 = O, R3 = CO2H;
(IVa) R1 + R2 = O, R3 = CO2NH(CH2)7CO2H;
(IV6) R1 + R2 = O, R3 = CO2NH(CH2)8CO2H;
(IVB) R1 + R2 = O, R3 = CO2NH(CH2)10CO2H;
(IVr) R1 + R2 = O, R3 = CO2NH(CH2)8CONHCH(Ph)CH2CO2H.
(I), (Ia, 6), (III), (IV), (IVa-r)
Производные глицирретовой кислоты (II).
r!Ö
"■v^COR2
(II) R1 = H, R2 = (IIa) R1 = H, R2 = (II6) R1 = H, R2 = (IIB) R1 = H, R2 = (IIr) R1 = H, R2 = (Пд) R1 = Ac, R2
OH;
= NH(CH2)4CO2H; = NH(CH2)SCO2H; = NH(CH2)6CO2H; NH(CH2)7CO2H; = NH(CH2)8CO2H;
(IIe) R1 = H, R2 = NH(CH2)10CO2H;
(Пж) R1 = H, R2 = NH(CH2)8CONHCH(Ph)CH2CO2H.
(II), (IIa-ж)
Влияние производных тритерпеноидов на рост и апоптоз клеток опухолевых клеточных линий MT-4, MOLT-4, CEM (клетки Т-клеточных лейкозов человека) и Hep G2 (клетки карциномы печени человека) исследовали с помощью MTT-теста и метода проточной цитометрии, соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для исследования действия экспериментальных препаратов на клеточный рост использовали MTT-тест (микротетразолиевый тест), который является базовым в Европе и США при внесении соединений на регистрацию в качестве лекарственных средств. MTT-тест используется для оценки в эксперименте цитотоксичности потенци-
ально противоопухолевых соединений и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиумбромида до голубого кристаллического фармазана, растворимого в DMSO. С его помощью оценивалось инги-бирование интенсивности окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках исследуемыми веществами и определялась их 50%-ная ингибирующая доза (ИД50) [16, 17].
Значения ИД50 для растительных тритерпе-нов (I)—(III) и их модифицированных производных приведены в табл. 1. Из результатов, представленных в таблице, видно, что клеточные линии в разной степени чувствительны к действию тритерпе-нов. Значение ИД50 исследованных соединений ко-
Taблицa 1. Ингибирование роста опухолевых клеток производными бетулина и глицирретовой кислоты*
Соединение
Клеточная линия
MT-4 MOLT-4 CEM Hep G2
(I) 40.0 33.0 65.0 62.4
(Ia) 40.0 36.5 58.0 70.0
(I6) 10.0 21.5 32.0 50.0
(IIa) 87.5 85.0 73.25 160.0
(II6) 75.0 96.0 61.0 >200
(IIB) 125.4 78.0 80.0 175.0
(IIr) 95.0 52.0 72.0 87.5
(Пд) 47.5 50.0 35.0 60.0
(IIe) 125.0 150.0 90.0 200.0
(Пж) 80.0 115.0 77.5 100.0
(III) 28.4 22.8 5.0 54.0
(IVa) 25.0 10.3 8.75 32.0
(IV6) 20.0 16.0 12.5 32.0
(IVB) 32.0 10.0 8.0 32.0
(IVr) 4.2 5.0 7.0 25.0
* Приведена величина ИД50 (мкг/мл).
лебалось между 4.2 и 200 мкг/мл. Амиды бетулоновой кислоты (IVa)-(IVr) были более активными ингибиторами роста опухолевых клеток, чем соответствующие амиды глицирретовой кислоты (Нг)—(Нж) (ИД50 35.0—200.0 мкг/мл), они ингиби-ровали рост клеток в меньших концентрациях (ИД50 4.2—32.0 мкг/мл). Следует отметить, что производные глицирретовой кислоты, содержащие фрагмент аминооктановой или аминононановой кислоты, а также дипептида (IIr), (Пд), (Пж) являются более активными ингибиторами роста опухолевых клеток, чем соответствующие амиды, содержащие остатки аминомасляной, аминопентановой, аминогексановой или аминоундекановой кислот. Таким образом, длина спейсера оказывает влияние на антипролиферативные свойства соединений в отношении опухолевых клеток. Ингибирующая активность С28-моносукцината 3-ацетата бетулина (I6) в отношении клеток линий Hep G2, МТ-4 и MOLT-4 более выраженная, чем у бетулина, была аналогична активности бетулиновой кислоты.
Необходимо отметить, что в литературе известны примеры высокоактивных цитотоксичных 3ß-ацетоксилупанов, также содержащих С28-карбоксифункцию [18]. Высокой ингибирующей активностью по отношению к росту опухолевых клеток обладали амиды (IVa)-(IVß) и амид бетулоновой кислоты (IVr). При этом соединения (IVa)— (IVr) оказались более активными ингибиторами
роста опухолевых клеток, чем бетулиновая кислота (III). Длина метиленового звена ^H2)n (n = 7, 8, 10) в амидном остатке незначительно меняла ингибирующую активность, однако введение второго амидного остатка приводило к увеличению ингибирования роста опухолевых клеток (соединение (IVr)).
Далее нами исследовано влияние наиболее активных ингибиторов лупанового типа — сукцинатов бетулина (Ia), (I6) и амидов бетулоновой кислоты (IVa)—(IVr) на уровень апоптоза в клетках опухолевых клеточных линий методом проточной цитометрии [19]. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.
Как видно из данных табл. 2, действие производных бетулина на клетки во всех случаях приводило к развитию апоптоза, эффективность индукции которого зависела от структуры соединения, продолжительности инкубации и типа клеток. Апоптозин-дуцирующая активность сукцинатов бету
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.