МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 456-463
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.262
ВЛИЯНИЕ BACILLUS SUBTILIS НА МИКРОБНОЕ СООБЩЕСТВО РУБЦА И ЕГО ЧЛЕНОВ, ИМЕЮЩИХ ВЫСОКИЕ КОЭФФИЦИЕНТЫ КОРРЕЛЯЦИИ С ПОКАЗАТЕЛЯМИ ПИЩЕВАРЕНИЯ, РОСТА И РАЗВИТИЯ ХОЗЯИНА
© 2013 г. Н. А. Ушакова*, ^ Р. В. Некрасов**, Н. А. Мелешко**, Г. Ю. Лаптев***, Л. А. Ильина***, А. А. Козлова*, А. В. Нифатов*
*Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Москва **ГНУВИЖРоссельхозакадемии, Московская обл., Дубровицы ***ОООНаучно-производственная компания "Биотроф", Санкт-Петербург, Колпино
Поступила в редакцию 10.04.2012 г.
Исследования состава микробного сообщества рубцовой жидкости бычков методом T-RFLP-ана-лиза показали, что введение с кормами массы защищенных биопленкой клеток Bacillus subtilis вызвало изменения в микробиоценозе. У контрольных животных, перешедших с молочной на растительную диету, доминировали бактерии филума Firmicutes (55.11 ± 1.97%), класса Clostridia (53.10 ± 2.06%), с основной долей семейств Lachnospiraceae (25.93 ± 1.41%) и Clostridiaceae (9.90 ± 1.35%). Присутствовали члены филума Bacteroidetes (11.15 ± 2.88%) и филума Actinobacteria (9.27 ± 1.95%). Доля некультиви-руемых форм составила 17.28 ± 2.01%. Содержание бацилл сем. Bacillaceae было менее двух процентов (1.46 ± 0.41%). Попадание в рубец опытных животных клеток B. subtilis вызвало увеличение доли сем. Bacillaceae до 2.80 ± 0.30%. На порядок выросла численность Thermoanaerobacteriaceae, Peptostreptococcaceae, Alicyclobacillaceae. В 2 раза увеличилось количество Pseudomonadaceae, Burkholderi-aceae, некультивируемых Bacteroidetes. Повысились показатели эффективности пищеварения — увеличилось количество рубцовых бактерий и простейших, летучих жирных кислот, выделение аммиака. Ряд семейств, в том числе доминирующих, включал представителей с различной направленностью корреляционных связей с показателями рубцового пищеварения. Введенные бациллы стимулировали те фило-типы, которые имели положительные коэффициенты корреляции, и ингибировали формы, связи которых были отрицательными — произошла перестройка микробной экосистемы содержимого рубца в сторону повышения положительного влияния на пищеварение. Обсуждается функциональная роль членов микробного сообщества, корреляционные связи которых отрицательны, слабо связаны или не связаны с показателями рубцового пищеварения.
Ключевые слова: симбиотические взаимодействия, микробное сообщество, молекулярно-генетиче-ский метод, T-RFLP-анализ, корреляционные связи.
DOI: 10.7868/S0026365613040125
Развитие фундаментальных исследований сим-биотических взаимодействий организма и его мик-робиоты получило новое направление в связи с созданием метагеномных методов анализа структуры микробного сообщества [1, 2], среди которых одним из наиболее достоверных является метод T-RFLP [3]. Современные технологии дают возможность углубленного изучения механизмов воздействия различных факторов на организм хозяина и его микросимбионтов, позволяют оценить характер межмикробных отношений, в том числе, внутри кишечной экосистемы, например,
1 Автор для корреспонденции (e-mail: naushakova@ gmail.com).
при поступлении в организм массы посторонних бактерий в составе биологически активных кормовых добавок. Большой теоретический и практический интерес представляют технологии получения нового поколения таких добавок, связанные с образованием биопленок на твердом носителе. Биопленки в природе играют защитную роль для образующих их бактерий [4—6]. Поэтому получение биопленки позволяет повысить выживаемость микробной популяции в неблагоприятных условиях высушивания, грануляции и т.п., и клетки, закрепленные на частицах твердого носителя, могут активно влиять на микробный ценоз желудочно-кишечного тракта.
Цель настоящей работы — с помощью метода T-RFLP-анализа, модифицированного для исследований рубцовых бактерий [7], изучить микробное сообщество рубцовой жидкости бычков, перешедших с молочной на растительную диету; исследовать влияние вегетативных клеток Bacillus subtilis, поступивших с кормами в организм молодых животных в виде биопленки на фитоносите-ле, на микробную экосистему химуса рубца и межмикробные взаимодействия внутри нее; оценить изменения количества отдельных представителей микробиоты, обладающих высокими коэффициентами корреляционных связей с показателями пищеварения, ростом и развитием хозяина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штамм Bacillus subtilis В-8130. Твердофазное культивирование бактерий проводили на измельченных листьях облепихи [8] при 50% влажности массы, которую по окончании ферментации высушивали при 45°С до воздушно сухого состояния. Количество клеток бациллы (КОЕ/г) определяли методом предельных разведений. Отсутствие спор контролировали световой микроскопией фиксированных мазков водных суспензий препарата, окрашенных генци-анвиолетом, с использованием микроскопа Ax-ioskop ("Zeiss", Germany) и компьютерной системы анализа изображений KS 300.
Электронную микроскопию осуществляли при помощи сканирующего электронного микроскопа CamScan МВ2300 (Чехия). Для этого на покровное стекло (S = 18 х 18 мм) помещали каплю изотонического (0.5 М) раствора сахарозы [9] и сверху осторожно насыпали сырую ферментационную массу, содержащую бактериальные клетки. Высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение суток. Стекла прикрепляли с помощью двухсторонней проводящей углеродной ленты к поверхности манипуляционного столика. Препараты напыляли золотом под вакуумом согласно стандартной процедуре приготовления препаратов для электронной сканирующей микроскопии.
Из телят экспериментального хозяйства ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии "Кленово-Чегодае-во", отд. "Дубровицы", в возрасте 25—30 дней методом аналогов были составлены 2 группы по 10 особей: 1 — контрольная и 2 — опытная. Животные 1 контрольной группы получали комбикорм без добавок. В состав комбикорма для 2 опытной группы дополнительно ввели 0.1% высушенной биомассы B. subtilis В-8130 в виде биопленки на фитоносителе. Опытное кормление проводили в течение 105 дней. При этом осуществляли ежедневный учет задаваемых кормов и их остатков для оценки потребления кормов. Для контроля за живой массой животных проводили
их индивидуальное взвешивание при постановке и снятии с опыта. На основании полученных данных рассчитывали общие и среднесуточные приросты. По окончании опыта анализировали показатели процесса пищеварения [10]. Для характеристики рубцового пищеварения у животных зондом отбирали пробы содержимого рубца через 3 ч после кормления. В полученных пробах определяли кислотность с помощью рН-метра Акви-лон-410. Затем рубцовое содержимое фильтровали через 4 слоя стерильной марли, и в жидкой части определяли: (1) общее количество летучих жирных кислот (ЛЖК) — методом паровой дистилляции в аппарате Маркгама; (2) аммиачный азот — микродиффузным методом по Конвею; (3) количество биомассы простейших и бактерий — методом дифференцированного центрифугирования на центрифуге Beckman (Германия) model J2-21 Centrifuge [11] с последующим получением абсолютно сухой биомассы.
Полученные в опыте материалы обрабатывали биометрически с использованием ¿-критерия Стъюдента.
Видовой состав микробного сообщества рубцовой жидкости 6 бычков (по 3 животных из контрольной и опытной групп) в возрасте 4.5 мес. исследовали методом T-RFLP-анализа. ДНК из содержимого рубца выделяли экстракцией фенолом/хлороформом и очисткой раствором 2% CTAB. ПЦР-амплификацию генов 16S рРНК бактерий проводили с использованием праймеров: 63F (CAGGCCTAACACATGCAAGTC) - с меткой на 5'-конце (флуорофор D4 — WellRed) и 1492R (TACGGHTACCTTGTTACGACTT), которые позволяют амплифицировать фрагмент гена 16S рРНК с позициями от 63 до 1492 (нумерация указана для гена 16S рРНК Esherichia coli).
T-RFLP-анализ. Флуоресцентно меченные ампликоны гена 16S рРНК очищали с помощью раствора 3 М гуанидин-изотиоционата по стандартной методике [12]. Концентрацию очищенных фрагментов гена 16S рРНК определяли с помощью флюориметра Qubit 2.0 ("Invitrogen", Карлсруэ, ФРГ) согласно рекомендации изготовителя. Рестрикцию 30—50 нг ампликонов 16S рРНК проводили рестриктазами HaeIII, HhaI и MspI, следуя рекомендации изготовителя ("Fermentas", Литва), в течение 2 ч при 37°С. Продукты рестрикции осаждали этанолом, затем смешивали с добавлением 0.2 мкл маркера молекулярного веса Size Standart-600 ("Beckman Coulter", США) и 10 мкл формамида Sample Loading Solution ("Beckman Coulter", США) и анализировали с помощью CEQ 8000 ("Beckman Coulter", США) согласно рекомендациям производителя. Вычисление размеров пиков и их площади проводили в программе Fragment Analysis ("Beckman Coulter", США), на основании чего выделяли подтипы
r™Zh
v
'J&A - v. v т . Ч i ' д
ШЖ • ■4M. Л> Ж,
7 л - : Ы
(а) 20 um 1 г 1
^ \ ф
X
\ .
(б) ■ 10 um
Электронные микрофотографии: а — сырой продукт твердофазной ферментации, клетки B. subtilis В-8130 (отмечены стрелками) в массе биопленки; б — сухой препарат, клетки (отмечены стрелками) в большинстве покрыты сверху пленкой.
(филотипы) с принятой в исследовании погрешностью в 1.5 нуклеотида и определяли их процентное содержание в микробном сообществе. Принадлежность бактерий к определенной филогенетической группе определяли с использованием программы Fragment Sorter (http://www.oardc. ohiostate.edu/trflpfragsort/index.php).
Для объяснения причинно-следственной связи между факторными и результативными признаками рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона [13] между количеством микроорганизмов в рубце бычков и показателями рубцового пищеварения (рН, выделением аммиака, летучих жирных кислот, количеством бактерий и простейших), позволяющие установить прямые связи между переменными величинами по их абсолютным значениям. Для подсчета использовали формулу в сокращенном варианте [14]:
г I (X - X)(у - У)
" Л (X - X)21 (У - У )2'
где X — значения, принимаемые переменной количества бактерий;
У — значения, принимаемые переменной количества ЛЖК, либо аммиака, либо биомассы простейших
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.