РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 58-63
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ У МЫШЕЙ ПРИ ИММУНОСУПРЕССИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ЦИКЛОФОСФАНОМ
© 2009 г. Н.К. Ахматова, О.М. Кузьменко, О.В. Кунягина, Е.А. Лебединская*, И.М. Грубер
ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;
*ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ», Пермь, Россия
Поступила: 15.10.08 г. Принята: 02.02.09 г.
Изучено влияние стафилококковой вакцины (СВ) на продукцию цитокинов у мышей при индуцированной иммуносупрессии. Мышам 4-х кратно вводили циклофосфан (100 мг/кг). Через 24 часа внутрибрюшинно вводили 200 мкг СВ. СВ на фоне ЦФ значительно повышала уровень ИЛ-5 по сравнению с ЦФ и контролем. На шестые сутки вакцина усиливала продукцию ИФНс, а в сыворотках крови мышей предотвращала чрезмерный выброс ФНОа и сдерживала резкое падение ИЛ-6. Полученные данные свидетельствуют о корригирующем влиянии Стафиловак на индуцированную иммуно-супрессию.
Ключевые слова: бактериальная вакцина, цитокины, иммуносупрессия, циклофосфан
ВВЕДЕНИЕ
В онкологической практике существует проблема гематотоксичности противоопухолевых препаратов, которая является серьезным ограничением в достижении максимального терапевтического эффекта. В то же время принципы современной химиотерапии требуют применение противоопухолевых препаратов, оказывающих максимально повреждающее действие на опухолевые клетки. А этот эффект может быть достигнут путем введения максимально переносимых доз цитостатиков, обладающих токсическим действием не только на опухолевые, но и здоровые клетки организма [1]. Поэтому создание оптимальных условий для реализации действия высоких доз цитостатиков при снижении их побочных эффектов является одной из важнейших задач современной медицины. К тому же в практике часто встречаются состояния, когда не только фармакологические препараты вызывают имму-носупрессию, но и инфекционный процесс, который сам нередко развивается на фоне иммунодефицита.
Иммуносупрессии часто сопровождаются инфекционным процессом, вызванным условно патогенной микрофлорой, в том числе стафилококком, часто осложняющимся развитием гнойно-септических заболеваний [2, 3]. Трудность терапии стафилококковой инфекции определяется широкой распространенностью данного возбудителя в окружающей среде, резистентностью к широкому спектру антибиотиков, восприимчивостью пациентов с ослабленным иммунитетом и усугублением течения вторичных иммуноде-фицитов в результате иммуносупрессивного действия самого возбудителя, а также антибиотиков [4, 5]. Эти факты определяют необходимость комплексной терапии индуцированной иммуносупрессии и профилактики стафилококковой инфекции, сочетающей использование бактериостатических препаратов и иммуномодуляторов.
В НИИВС им. И.И. Мечникова разработана сухая бесклеточная стафилококковая вакцина «Стафиловак», обладающая специфическим действием в отношении стафилококковой инфекции, и оказывающая неспецифическое действие на эффекторную систему иммунитета. Препарат разрешен к применению в клинической практике (Приказ МЗ РФ № 144/53 от 10 апреля 1996 года) и
представляет собой комплекс антигенов клеточной стенки стафилококка, полученный методом водной экстракции из высушенной ацетоном микробной массы Staphylococcus aureus. Конструкция была получена из слабовирулентных штаммов, обладающих высокой иммуногенностью и широкой протективной активностью в отношении условно патогенной микрофлоры.
Целью исследования явилось изучение влияния стафилококковой вакцины «Стафи-ловак» на продукцию цитокинов у мышей при индуцированной циклофосфаном имму-носупрессии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мышам линии Balb/c (10—12 мг) вводили по 100 мг/кг внутрибрюшинно четырехкратно циклофосфан-Лэнс (Россия) с интервалом 24 часа. Спустя сутки внутрибрюшинно однократно вводили по 200 мкг сухую бесклеточную вакцину «Стафиловак», разведенную в изотоническом растворе хлорида натрия. Через различные интервалы времени (4, 24 и 120 часов) после иммунизации у животных извлекали селезенку под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». В каждой группе было по 10 животных.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) селезенок мышей. Селезенки мышей гомогенизировали, добавляли среду 199. Затем полученную взвесь спленоцитов центрифугировали при 400 g в течение 30 минут в градиенте плотности фиколл-урографин («Pharmacia», плотностью 1,077 г/см3). МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды, клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Концентрацию клеток доводили до 1 • 106 кл/мл. Для получения супернатантов МЛ инкубировали 48 часов в обогащенной среде культивирования (RPMI-1640 с добавлением 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10% термоактивированной эмбриональной телячьей сыворотки).
Цитокины определяли в сыворотках мышей и супернатантах культур МЛ селезенок при помощи иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов для определения цитокинов фирмы Bender (Швеция).
Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стъюден-та, критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0).
РЕЗУЛЬТАТЫ
У мышей в культуре МЛ селезенок через 120 часов (рис.1) после введения СВ увеличивалась концентрация ИЛ-13 при стимуляции КонА по сравнению со спонтанной индукцией и контролем (p < 0,05). В то же время наблюдалось увеличение уровня ИЛ-13 в группе с ЦФ (спонтанная и индуцированная продукция) по сравнению с контролем и группой, получившими ЦФ в сочетании с СВ (p < 0,05). В более ранние сроки (24 часа) этих изменений не отмечено, что свидетельствует о более поздней активации провоспалительных механизмов в культуре клеток под воздействием как СВ, так и ЦФ. В других группах существенных сдвигов в отношении данного цитокина не выявлено. Что касается ЦФ, то, возможно, именно на 6 сутки начинается восстановление сбоев иммунного реагирования при индуцированной иммуносупрессии, выраженной в компенсаторном повышении ИЛ-13.
Существенных сдвигов в отношении уровня ИЛ-4 в культуре МЛ селезенок не отмечено. Через 24 часа после введения препаратов мышам выявлялось незначительное угнетение выработки ИЛ-4 мононуклеарами (во всех группах) по сравнению с контролем, а через 120 часов этот показатель возвращался к исходному уровню во всех исследуемых группах.
Через 24 часа незначительно увеличивался уровень спонтанной продукции ИЛ-5 в группе ЦФ + СВ (по сравнению со стимулированной культурой и контролем), а через 120 часов этот показатель в данной группе превышал значения контроля в 16,8 и 9,5 раз при спонтанной и стимулированной индукции, соответственно. В группе ЦФ + СВ концентрация ИЛ-5 была выше в 1,8 раз (спонтанная продукция) и 1,3 раз (стимулированная) по сравнению с ЦФ. Введение одной вакцины приводило к нарастанию уровня данного цитокина в 2,6 (спонтанная продукция) и 3,6 (стимулированная) раз по сравнению с контролем.
Сама вакцина через 24 часа после введения повышала уровень спонтанного ИФНс в 4 раза и индуцированного — в 8 раз по сравне-
Рис. 1. Динамика цитокинов в супернатантах культур селезенок мышей при введении стафилококковой вакцины.
нию с контролем, а через 120 часов в 12,5 и 5,2 раз, соответственно. ЦФ угнетал продукцию ИФНс в исследyемые сроки.
СВ на фоне ЦФ через 24 часа усиливала продукцию индуцированного ИФНс в 2,6 раз по сравнению с СВ, в 21 раз по сравнению с контролем и в 424,5 раз по сравнению с ЦФ. Через 120 часов индуцированная продукция ИФНс постепенно начинала снижаться, но была выше активности МЛ контроля почти в 3 раза и ЦФ в 89,4 раз. Эти данные свидетельствует о способности вакцины усиливать продукцию ИФНс и оказывать некоторое корригирующее влияние на имммуносупрессивные механизмы ЦФ.
ФНОа в группе СВ через 24 часа был снижен в 3,6 раза (спонтанная продукция) и 1,7 раз (стимулированная продукция) по сравнению с контролем. ЦФ также снижал уровень его спонтанной продукции в 1,7 раза по сравнению с контролем, а СВ на фоне ЦФ в 4 раза.
Через 120 часов уровень стимулированной ФНОа в группе СВ был выше в 1,8 раз (по сравнению с контролем). В этот период у мышей с ЦФ уровни ФНОа достигали исходных
значений, а в группе ЦФ + СВ отмечалось угнетение продукции данного цитокина.
Наиболее сильно менялось содержание ИЛ-6 (рис. 2 Г) в культуре МЛ через 120 часов после введения мышам препаратов. Если через 24 часа уровень ИЛ-6 в группе с СВ сопоставим с контролем, то уже на пятые сутки повышался в 32,6 раз (спонтанная продукция) и 5,5 раз (стимулированная продукция). Через 24 часа спонтанная продукция ИЛ-6 при введении ЦФ повышалась в 3,8 раз (202,5 пкг/мл), при этом угнеталась его стимулированная продукция в 1,6 раза (55 пкг/мл) по сравнению с контролем. ЦФ + СВ подавляли выработку данного цитокина в 1,5 раз (спонтанная продукция) и 1,2 раз (стимулированная продукция) по сравнению с контролем.
Спустя 120 часов после введения ЦФ отмечалось усиление синтеза ИЛ-6 мононуклеар-ными лейкоцитами селезенок почти в 46 раз (спонтанная продукция) и в 24,7 раз (стимулированная продукция), а СВ на фоне ЦФ усиливала продукцию (как стимулированную, так и спонтанную) в 24,6 раза по сравнению с контролем. По сравнению с ЦФ вакцина снижала спонтанную индукцию ИЛ-6 в 1,9 раз, тем
Рис. 2. А-В Динамика цитокинов в сыворотках крови мышей при введении стафилококковой вакцины. Г — Содержание ИЛ-6 в супернатантах МЛ селезенок мышей при введении стафилококковой вакцины.
самым оказывая некоторое корригирующее действие на продукцию данного цитокина.
Оценка содержания цитокинов в сыворотках мышей (рис.2) при введении препаратов показала: через 4 часа отмечалось повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-12 в группе ЦФ + СВ (р < < 0,05), ИЛ-5 и ФНОа (р > 0,05) по сравнению с ЦФ, и содержание данных цитокинов в группе ЦФ + СВ статистически значимо не отличалось от контро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.