МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 1, с. 89-95
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 582.264.12.017.6+579.262
ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИЙ-СПУТНИКОВ НА РОСТ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII В АЛЬГО-БАКТЕРИАЛЬНОМ СООБЩЕСТВЕ
© 2008 г. Ю. А. Николаев*1, В. К. Плакунов*, Н. А. Воронина*, Н. В. Немцева**, А. О. Плотников**, О. А. Гоголева**, М. Е. Муравьева**, Г. В. Овечкина***
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Институт клеточного и внеклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург ***Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Поступила в редакцию 09.01.2007 г.
Исследованы ростовые характеристики альго-бактериального сообщества (Chlamydomonas rein-hardtii и бактерий-спутников) и способы воздействия на водоросль со стороны бактерий. Изолированы и частично охарактеризованы 4 доминирующих штамма бактерий. Они отнесены к следующим таксонам: Rhodococcus terrae, Micrococcus roseus и Bacillus spp. С помощью рассева разведений суспензии на твердые среды, содержащие ампициллин, получена чистая культура изучаемых водорослей. Показано, что в составе альго-бактериальной ассоциации водоросли обладали большей скоростью роста (0.76 сут-1) и давали больший урожай (60 мкг хлорофилла/мл культуры), чем чистая культура водоросли (0.4 сут-1 и 10 мкг хлорофилла/мл культуры соответственно). При длительном хранении клетки водоросли в ассоциации сохраняли жизнеспособность лучше, чем в чистой культуре. Среди изолированных бактерий-спутников наиболее выраженным рост-стимулирующим действием обладали штаммы Б1 и Ж1, отнесенные к виду Rhodococcus terrae, ускоряющие рост водорослей в 2 раза. Установлено, что культуральная жидкость, полученная после инкубации бактерий в неростовых условиях, при введении в ростовую среду стимулировала рост водорослей, тогда как культуральная жидкость активно растущих бактерий оказывала противоположное действие.
Ключевые слова: альго-бактериальное сообщество, Chlamydomonas reinhardtii, стимуляция роста, механизмы взаимодействия.
Альго-бактериальное сообщество является удобной системой для исследования многих аспектов экофизиологии (например, взаимоотношений продуцентов и консументов, межвидовой коммуникации и кооперации). Подавляющее большинство работ по ассоциациям водорослей и их бактериальных спутников посвящено исследованию трофических взаимоотношений [1-3], а также взаимному подавлению или кооперации [3, 4]. В последнее время популярной темой стали коммуникации между водорослями и бактериями-спутниками, опосредованные гомосеринлактонами или иными низкомолекулярными регуляторами [5, 6]. Водоросли в таком сообществе являются единственными поставщиками в систему питательных веществ, и, естественно, что все организмы, составляющие последующие звенья пищевой пирамиды, прежде всего, связаны с водорослями именно трофическими взаимоотношениями. Однако бактериальным компонентам сбалансированного сообщества не может быть безразлична активность и состояние водорослей, и, соответственно, должны существовать способы воздействия на водоросли со стороны бакте-
1 Адресат для корреспонденции (е-та11:п1к:о1аеууа@та11.ги).
рий-сиутников. Существуют лишь единичные работы, посвященные стимулирующему влиянию бактерий на водоросли [3]. Механизмы такого влияния разнообразны и не во всех случаях расшифрованы. В присутствии бактерий в среде повышается концентрация С02 и снижается уровень кислорода, что благоприятно сказывается на ассимиляционном коэффициенте и росте водорослей [7]. Другими причинами могут быть ускорение бактериями минерализации труднодоступных соединений и обогащение среды солями азота [8], а также синтез витаминов и ауксинов [9].
Целью настоящей работы было исследовать природу взаимоотношений в ассоциации одноклеточной зеленой водоросли Chlamydomonas re-inhardtii и ее бактериальных спутников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Альгологически чистая культура Chlamydomonas reinhardtii Dang. (Chlorophyta, Chlorophyceae, Volvocineae) получена из коллекции кафедры биофизики МГУ. Она представляет собой одноклеточную двужгутиковую зеленую водоросль,
обладающую правильной шаровидной, реже эллипсовидной, формой клетки. Типичный а-мезо-сапроб, т.е. в природе обитает в водах, умеренно загрязненных органическими веществами (лужах, прудах, болотах, озерах, реках) [10-13]. Для длительного наблюдения за развитием водорослей использовали метод висячей капли [10]. Для этого на чистое покровное стекло наносили каплю исследуемой культуры в питательной среде, после чего покровное стекло накладывали каплей вниз на предметное стекло с лункой посередине, и края покровного стекла герметизировали парафином. Изучение проводили в течение месяца, сохраняя препарат в перерывах между работой во влажной камере.
Культуру поддерживали на модифицированной среде HS состава (г/л): KH2PO4 - 1.0, K2HpO4 -1.3, NH4Cl - 0.54, MgSO4 ■ 7H2O - 0.12, Na-цитрат -0.32, CaCl2 ■ 2H2O - 0.05, FeCl3 ■ 6H2O - 0.003, микроэлементы по Хантеру [14]. В некоторых культурах C. reinhardtii микроскопическое исследование выявляло наличие бактериальных спутников. Для выделения бактериально чистой культуры водорослей использовали сочетание методов истощающего штриха [15] и ампицилиновой селекции, т.е. в ростовую среду вносили 2500 ед/мл ампициллина для элиминации бактерий. Полученную таким образом чистую культуру C. reinhardtii поддерживали на среде Прата состава (г/л): KNO3 - 0.10; K2HPO4 - 0.01; MgSO4 ■ 7H2O - 0.01; агар-агар - 1.2%; FeCl3 ■ 6H2O - 0.001 [12]. Для выделения бактерий использовали среду ГПД состава (г/л) : глюкоза - 5, пептон - 5, дрожжевой экстракт - 5, рН 7.0. Для определения пищевых потребностей выделенных штаммов использовали среду М9 [16] с добавлением различных источников углерода, а также жидкую среду Раймонда с добавлением дизельного топлива. Чувствительность к препарату яичного лизоцима определяли методом серийных разведений [17].
Для определения химического типа клеточной стенки неспорообразующих бактерий использовали стандартные методы [18]. Для определения дифференцирующих сахаров и получения метилмиколатов исследуемые штаммы выращивали на качалках (150 об/мин) в мясо-пептонном бульоне при 27°С в течение 96 ч, для обнаружения мезо-диаминопиме-линовой кислоты (ДАПК) - на скошенном мясо-пептонном агаре при 27°С в течение 48-72 ч. Обнаружение изомеров ДАПК проводили в гидролиза-тах целых клеток методом восходящей хроматографии в системе растворителей метанол : дистиллированная вода : 6 Н HCl : пиридин (80 : 26 : 4 : 10). Хроматограммы проявляли опрыскиванием 0.5% раствором нингидрина в ацетоне с последующим высушиванием и прогреванием в течение 2 мин при 105°С.
Миколовые кислоты определяли методом тонкослойной хроматографии. Метанолизаты целых клеток наносили на пластинки Silufol и хромато-графировали в системе растворителей петролей-ный эфир : диэтиловый эфир (85 : 15). В качестве проявителя использовали 5% спиртовый раствор фосфорномолибденовой кислоты.
Видовую идентификацию бактерий осуществляли по методам, описанным в литературе [19, 20].
Культуры водорослей выращивали в люмино-стате при постоянной освещенности (1000 лк) лампами дневного света в статических условиях при температуре 18-22°С. Для микроскопических исследований использовали микроскопы Dokuval, Axiostar plus ("Karl Zeiss, Jena", гДр) с фазово-кон-трастным устройством и цифровой фотокамерой.
Для изучения влияния на рост водорослей соединений, выделяемых бактериями, выращивали чистую культуру бактерий на среде М9 с глюкозой до поздней экспоненциальной фазы или фазы замедления роста, отделяли клетки центрифугированием, супернатант стерилизовали фильтрацией (Millipore, 0.2 мкм) и добавляли полученную куль-туральную жидкость (КЖ) бактерий к ростовой среде водорослей в количестве 50%. В контроле добавляли такое же количество свежей среды М9. За ростом водоросли следили, определяя содержание хлорофилла в жидкой среде или на чашках Петри (после смыва биомассы водоросли стерильной ростовой средой). Для выращивания водорослей на чашках Петри также использовали среду Прата. Биомассу водоросли собирали центрифугированием, экстрагировали хлорофилл этанолом, измеряли экстинкцию при 649, 665 и 750 нм. Содержание хлорофилла (Хл, мкг/мл) рассчитывали по формуле:
Хл = (6.1 Ö665 - £750) + 20.04 (Ö649 - Ö750)) К, [21]
где Е - экстинкция при соответствующей длине волны, К - разбавление культуры, 6.1 и 20.04 -коэффициенты экстинкции.
При совместном выращивании водорослей и бактерий на жидких средах создавали поликультуры, т.е. в жидкую среду М9 вносили инокуляты чистых культур водоросли (10 об. %) и одной из испытуемых бактерий (2-3 об. %) в стационарных фазах роста, после чего поликультуру выращивали как культуру водоросли, т.е. при 18-22°С при освещении в стационарных условиях. При совместном выращивании на плотных средах М9 или Прата на одну половину чашки Петри штрихом высевали водоросль, а на вторую - бактерию, после чего чашки помещали в люминостат.
Грам-статус бактерий определяли путем окраски по Граму [22].
Все эксперименты проводили в 3-9 повторно-стях, для расчета достоверности эксперимента (р) использовали t-тест Стьюдента или критерии
n-
Выход зооспор
Бесполое размножение
Зооспоры (n)
Рост и деление в пальмеллевидном состоянии
n+
R
Зооспоры (n)
Половое размножение
Зигоспора 2n
Изогамия
Зигота 2n
Рис. 1. Жизненный цикл хламидомонады (Chlamydomonas reinhardtii).
знаков и Вилкоксона [23], рассчитываемые с помощью программы Statistica 6.0 ("StatSoft", Inc, США). В связи с высокой вариабельностью роста водорослей и его зависимостью от времени года, абсолютные показатели роста водорослей существенно различались. По этой причине на иллюстрациях приведены результаты типичных экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Особенности культуры водоросли C. reinhardtii Dang
В процессе экспериментов в культуре водоросли обнаруживались клетки, отличающиеся от типичных вегетативных клеток C. reinhardtii Dang. Для их идентификации в периодической культуре с помощью метода висячей капли прослежен жизненный цикл C. reinhardtii. В лабораторных условиях в жизненном ц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.