МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 704-711
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.218
ВЛИЯНИЕ БЕЛКОВ-РЕГУЛЯТОРОВ RCSA И RCSB НА ЭКСПРЕССИЮ /их-ОПЕРОНА Vibrio fischeri В КЛЕТКАХ Escherichia coli
© 2003 г. Г. Б. Завильгельский*, В. Ю. Котова, И. В. Манухов
Федеральное государственное унитарное предприятие "ГосНИИгенетика",
Москва 117545 Поступила в редакцию 24.10.2002 г.
Изучено влияние белков RcsA и RcsB на экспрессию lux-регулона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. Показано, что RcsA ингибирует активность белка LuxR, в результате чего ослабляется экспрессия lux-генов, кодирующих люциферазу и редуктазу. Двухкомпонентная сигнальная система RcsC-RcsB активирует экспрессию lux-генов V. fischeri в условиях осмотического шока, что усиливает биолюминесценцию клеток E. coli, находящихся в ранней логарифмической стадии роста.
Ключевые слова: lux-оперон, Vibrio fischeri, регуляция транскрипции, LuxR, RcsA, осмотический шок, двухкомпонентная сигнальная система, RcsC, RcsB.
Белки RcsA и RcsB Eschirichia coli - активаторы транскрипции cps-оперона, гены которого определяют синтез капсулярного полисахарида, ко-лановой кислоты [1, 2], причем RcsB в качестве эффектора входит в состав двухкомпонентной сигнальной системы RcsC-RcsB (сенсор-эффектор) [3, 4]. RcsA обладает значительной гомологией с белком LuxR, активатором транскрипции lux-оперона морских бактерий Vibrio fischeri [5]. В клетках E. coli белки RcsA и LuxR расщепляются протеазой Lon [6-9].
Экспрессия lux-генов V. fischeri регулируется системой LuxI-LuxR, которая определяет зависимость интенсивности биолюминесценции растущих клеток от плотности популяции ("quorum sensing"): отсутствие свечения при малых концентрациях клеток и резкое усиление свечения при достижении популяцией критической плотности [10-12]. Lwx-регулон V. fischeri, luxRICDABEG, состоит из двух оперонов: luxR с промотором P; и luxICDABEG с промотором Pr [13]. Структурные гены luxAB определяют синтез а- и ß-субъединиц люциферазы. Бактериальные люциферазы являются гетеродимерами (aß) и катализируют окисление алифатического альдегида кислородом воздуха с помощью восстановленного флавинмононуклео-тида. Реакция сопровождается высвечиванием кванта сине-зеленого (490 нм) света.
Гены luxCDE определяют синтез редуктазы жирных кислот, восстанавливающей жирную кислоту до альдегида (тетрадеканаль), субстрата люциферазы. Ген luxG кодирует неактнвную флавин-редуктазу, гены luxI и luxR - регуляторные. Белок LuxI - ацил-синтетаза, катализирующая синтез
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru
ацильного производного лактон^-гомосерина, N-(3-оксогексаноил) лактон^-гомосерина, который играет роль автоиндуктора (АИ) в регуляции транскрипции lux-генов, образуя комплекс с го-модимером белка-активатора (LuxR)2. Комплекс [A^(LuxR)2], связываясь с lux-боксом (инвертированный повтор размером 20 п.н.) в области промотора Pr, обеспечивает контакт РНК-полимера-зы с промотором и инициацию транскрипции генов luxICDABEG [14]. В результате синтеза люциферазы LuxAB и редуктазы LuxCDE популяция клеток, достигшая критической плотности (выше 108 клеток/мл), начинает люминесциро-вать. При клонировании lux-регулона V. fischeri в клетках E. coli система регуляции транскрипции "LuxI-LuxR" действует столь же эффективно, как и в природных морских бактериях [15]. В отличие от систем типа "quorum sensing" двухкомпонент-ные сигнальные системы способны воспринимать внешние сигналы (голодание, изменение pH среды, обезвоживание, осмотический шок и др.), что дает возможность бактериальной клетке адекватно реагировать на изменения условий окружающей среды. Поэтому представляло интерес оценить влияние сигнальной системы RcsC-RcsB, а также белка-активатора RcsA на экспрессию lux-генов в клетках E. coli, содержащих гибридную плазмиду с lux-регулоном V. fischeri.
В настоящей работе показано негативное влияние белка RcsA на экспрессию lux-генов V. fischeri в клетках E. coli. Предполагается, что RcsA образует с LuxR неактивный гетеродимер. Установлено также, что в условиях осмотического шока биолюминесценция клеток значительно возрастает уже при низкой (менее критической) плотности логарифмической культуры клеток
E. coli и этот эффект определяется активностью двухкомпонентной сигнальной системы RcsC-RcsB.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Бактериальные штаммы и плазмиды. Использованы следующие штаммы E. coli K12: AB1157 F- thr-1 leuB6 proA2 his-4 argE3 thi-1 lacYl galK2 ara-14 xyl-5 mtl-1 tsx-33 rpsL31 supE44; AB1899 F-lon A1, остальные маркеры аналогичны маркерам штамма AB1157; MG1655 (прототроф); C600 thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 supE44 и производные с инсерци-онными и делеционными мутациями C600 rcsB::Tn10, C600 rcsA::Tn10, C600 Acrp; SG20781 lon+ cpsB10::lac-Mu-X imm, SG20780 Alon-510 (остальные маркеры аналогичны маркерам штамма SG20781) [3]; SG22163 malP::lacI4 и SG22186 Alon rcsA::kan (остальные маркеры аналогичны маркерам штамма SG22163) [16].
В работе использованы следующие гибридные плазмиды: pF1, на основе pBR322, содержит полный lux-регулон V. fischeri, встроенный по BamHI-сайту; pAC16, на основе pACYC184, также содержит полный lux-регулон V. fischeri [17]; pF2, производное pUC19, содержит гены luxAB V. fischeri под контролем промотора Plac; pXen7 и pXen4, на основе pUC19, содержат lux-оперон и гены luxAB Photorhabdus luminescens соответственно; pLeo1 и pLeo3, на основе pUC18, содержат lux-оперон и гены luxAB Photobacterium leiognathi соответственно [18]; pBRlonS679A, на основе pBR327, содержит в векторе pBR327 мутантный ген lonA, кодирующий неактивную Lon-протеазу, Lon S679A [19]; pDR200, производное pUC19, содержит ген rcsA [20].
Питательные среды и реактивы. Культуры бактерий выращивали на полноценной среде LB и минимальной среде M9 [21]. Среду Мак-Конки использовали для идентификации штаммов SG20780 и SG20781, формирующих на этой среде красные и белые колонии соответственно. Концентрации антибиотиков: ампициллин - 100 мкг/мл, тетрациклин - 10 мкг/мл, канамицин - 40 мкг/мл. Осмотический шок индуцировали сахарозой ("Сигма") в конечной концентрации 15%. Раствор с высокой концентрацией АИ получали, используя надоса-дочную фракцию ночной культуры AB1899 (pF1) согласно [17].
ДНК гибридных плазмид выделяли с помощью щелочной экстракции. Трансформацию клеток гибридными плазмидами проводили согласно [22].
Трансдукцию проводили стандартным методом, используя бактериофаг P1vir [21].
Бактерии растили на твердых средах (LB + + 1.7% агара) при 37 или 30°С. Ночные культуры переносили в жидкую среду LB или M9 и растили на качалке при 28°С. При достижении ранней стадии логарифмической фазы в среду добавляли индуктор осмотического шока (сахарозу, а в кон-
I
Рис. 1. Зависимость интенсивности люминесценции (I) клеток E. coli AB1899 lon- (pAC16) и AB1157 lon+ (pAC16) от оптической плотности (OD). Клетки ино-кулированы при начальной OD = 0.01 и росли в L-бу-льоне в присутствии ампициллина (200 мкг/мл) на качалке при 28°С. 1 - AB 1899 (p AC16); 2 - AB1157 (pAC16); 3 - AB1899 (pAC16, pDR200).
трольные образцы - равный объем питательной среды) и продолжали инкубировать при 28°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и продолжали инкубировать без перемешивания при 20-22°С. Оптическую плотность (OD) суспензии клеток определяли на колориметре КФК-2МП при X > 550 нм. Экспрессию lux-ге-нов контролировали, измеряя интенсивность биолюминесценции клеток (I).
Биолюминесценцию клеток, содержащих гибридные плазмиды, измеряли на люминометре, состоящем из фотоумножителя ФЭУ-85 и микровольтметра В2-15. Интенсивность биолюминесценции (I) измеряли при комнатной температуре в специальных кюветах, содержащих 200 мкл препарата. При необходимости к суспензии клеток добавляли 2-3 мкл субстрата люциферазы - 0.001%-ного спиртового раствора я-деканаля ("Sigma").
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Роль RcsA в экспрессии lux-регулона V. fischeri в штаммах E. coli, мутантных по гену lon
Сравнение влияния миссенс-мутации и деле-ции в гене lon E. coli на экспрессию /мх-регулона V. fischeri. Cериновая ATP-зависимая Lon-протеа-за E. coli расщепляет LuxR, ключевой белок системы LuxI-LuxR, и тем самым участвует в негативной регуляции транскрипции lux-оперона в клетках E. coli [8, 9, 17]. Влияние Lon-протеазы на экспрессию lux-генов фенотипически проявляется в кривой зависимости интенсивности биолюминесценции клеток E. coli, содержащих гибридную плазмиду pAC16 (или pF1) с полным lux-регу-лоном V. fischeri и растущих в L-бульоне, от концентрации клеток: интенсивность биолюми-
I Al
104 - ■ 2
A3
103
102
101 - \
10° 1- ■ -¥—
к2
^3
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
OD
Рис. 2. Зависимость интенсивности люминесценции (I) клеток E. coli SG20780 Mon (pF1) и SG20781 lon+ (pF1) от OD. Условия роста как и на рис. 1. 1 - SG20780 (pF1); 2 - SG20781 (pF1); 3 - VK780 (pF1).
несценции I клеток мутантного штамма AB1899 lon на несколько порядков выше, чем у клеток штамма AB1157 lon+, уже начиная с минимальных значений OD (рис. 1).
В штамме AB1899 мутация в гене lon относится к миссенс-мутациям, поэтому представляло интерес изучить экспрессию lux-генов V. fischeri в клетках E. coli с полностью делетированным геном lon. Результат оказался неожиданным. Картина зависимости интенсивности биолюминесценции от OD популяции растущих клеток у штаммов SG20781 lon+ (pAC16) и SG20780 Alon-510 (pAC16) прямо противоположная: делеционный мутант SG20780 (pAC16) характеризуется резко сниженной биолюминесценцией при всех значениях OD и, следовательно, низким уровнем экспрессии lux-генов (рис. 2).
Таблица 1. Сравнение эффективности экспрессии lux-генов V. fischeri, в составе гибридных плазмид в штаммах E. coli SG20781 lon+ и SG20780 Alon-510
Плазмида
Интенсивность биолюминесценции, мкВ/200 мкл
SG20781 lon+, I81 SG20780 Alon-510, I80 Отношение I80/I81
pF1 5 x 103 10 2 x 10-3
pF2 2 x 105 1 x 105 0.5
pLeo1 1 x 105 1.5 x 105 1.5
pLeo3 5 x 105 3 x 105 0.6
pXen7 3 x 104 1 x 104 0.3
pXen4 8 x 105 8 x 105 1.1
Примечание. Клетки растили до ОБ = 0.4-0.5 при 25°С, Интенсивность биолюмин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.