ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2014, том 88, № 5, с. 876-881
= ФОТОХИМИЯ И МАГНЕТОХИМИЯ =
УДК 544.526 : 544.431.6 + 577.355
ВЛИЯНИЕ БИОГЕННЫХ ФОТОХРОМНЫХ АКЦЕПТОРОВ ЭЛЕКТРОНА
НА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЮ ХЛОРОФИЛЛА
© 2014 г. А. В. Лобанов, И. В. Клименко, О. В. Неврова, Т. С. Журавлева
Российская академия наук, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва
E-mail: inna@deom.chph.ras.ru Поступила в редакцию 24.07.2013 г.
Показано, что фотофизические свойства хлорофилла а (Хл) зависят от природы и относительного количества 2-метил-1,4-нафтохинона (МНХ) и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ). В водно-этанольных растворах Хл (1 х 10-5 М) и НАДФ (5 х 10—6—5 х 10-4 М) выявлено фоторазделение зарядов, приводящее к динамическому тушению флуоресценции Хл. При концентрации НАДФ > 5 х 10-4 М установлено координационное взаимодействии Хл и НАДФ. Нелинейная зависимость Штерна—Фольмера в этом диапазоне обусловлена вкладом статического типа тушения. Показано, что при концентрациях Хл 1 х 10-5 М и МНХ 6.7 х 10-5—1 х 10-4 М тушение флуоресценции Хл в этанольном растворе с МНХ в координатах Штерна—Фольмера описывается линейными участками; в этих условиях комплексообразования между Хл и МНХ не происходит, и процесс переноса электрона имеет динамический тип, с повышением концентрации МНХ доминирует процесс переноса энергии с МНХ на Хл статического или смешанного типа.
Ключевые слова: хлорофилл, перенос энергии, перенос электрона, флуоресценция.
Б01: 10.7868/80044453714050197
Взаимодействие природных и синтетических порфиринов с биологически активными соединениями, включающее перенос электрона, энергии и в ряде случаев стадии надмолекулярной самоорганизации, играет важную роль в фотобиологических и фотомедицинских процессах. В природном фотосинтезе электроны от молекул хлорофилла (Хл) в возбужденном синглетном состоянии последовательно передаются по электронтранс-портной цепи с участием обратимых переносчиков, таких как никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (НАДФ) и производные хинонов. Молекула НАДФ обнаружена во всех типах клеток. В хлоропластах растительных клеток при световых реакциях фотосинтеза НАДФ восстанавливается, принимая на себя водород и электроны ферредоксина, и затем обеспечивает водородом синтез углеводов в темновых реакциях цикла Кальвина [1]. Хиноидные соединения группы витаминов К, к которым относится 2-метил-1,4-нафтохинон (МНХ, витамин К3), служат переносчиками электронов в биохимических реакциях, в результате которых синтезируется клеточный источник энергии АТФ. Кроме того, молекулу МНХ можно рассматривать в качестве упрощенного аналога витамина К1, участвующего в качестве переносчика электрона в фотосинтезе [2].
Энергетика и динамика переноса электрона от Хл к НАДФ и хинонам изучены достаточно подробно на нативных объектах и в условиях, моде-
лирующих количественный состав фотосинтетического аппарата [3, 4]. Однако сложность молекулярной структуры НАДФ и МНХ и наличие полос поглощения в видимой области и ближнем УФ-диапазоне не могут исключить и альтернативные пути взаимодействия НАДФ и МНХ с Хл в зависимости от их количественного соотношения. При этом возможны как комплексообразо-вание, так и перенос энергии возбуждения. В настоящей работе рассмотрено взаимодействие Хл с фоточувствительными акцепторами электрона НАДФ и МНХ в широком интервале концентраций с использованием спектральных методов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Хлорофилл а (Хл) выделяли из листьев крапивы, высушенной на воздухе. Для этого 23 г крапивной муки, прогретой в течение 2 ч при 50°С, заливали 500 мл 80%-ного водного раствора ацетона и интенсивно перемешивали в течение 5 мин. Экстракт отфильтровывали. В полученный экстракт пигментов добавляли 50 мл охлажденного диоксана. Смесь охлаждали на льду и по каплям добавляли 70 мл охлажденной воды, после чего оставляли в холодильнике на 2 сут при 4°С. Выпавший осадок отфильтровывали под вакуумом на водоструйном насосе. По данным метода тонкослойной хроматографии (ТСХ), полученный осадок представляет смесь хлорофиллов
a и b, феофитина и каротиноидов. В системе растворителей эфир — гексан (1 : 3) хлорофилл имеет отношение фронтов R = 0.2, для каротиноидов R = = 0.8. Смесь пигментов смывали с фильтра смесью эфир — гексан (3 : 7) под вакуумом. Получившийся раствор наносили по каплям на хромато-графическую колонку с сахарозой (пудрой), предварительно прогретой при 100°C в течение 4 ч. Элюировали смесью эфир — гексан (3 : 7) до разделения и заметного распределения пигментов по колонке. Слой сахарозы, содержащий Хл, механически извлекали из колонки, подсушивали на воздухе и подвергали экстракции эфиром. Эфирный раствор Хл упаривали в темноте при комнатной температуре на роторном вакуумном испарителе.
Хлорофилл b (Хл1) был получен в МИТХТ. Чистоту пигментов контролировали методом ТСХ и
по электронным абсорбционным спектрам с помощью спектрофотометра DR/4000V (HACH-Lange, США) в диапазоне длин волн X = 320—800 нм.
2-Метил-1,4-нафтохинон (Аего8 О^ашеБ, США) и никотинамидадениндинуклеотидфос-фат ("Реанал", Россия) использовали без дополнительной очистки. Спектральные свойства соединений соответствовали представленным в литературе [5]. В эксперименте использовали растворы Хл и МНХ ([Хл] = 1 х 10-5 М, [МНХ] = = 6.7 х 10-5—1 х 10-1 М) в этаноле, а также Хл и НАДФ ([Хл] = 1 х 10-5 М, [НАДФ] = 5 х 10-6-5 х х 10-3 М) в водно-этанольной смеси 1 : 1. В ряде случаев также использовали Хл1 в аналогичных условиях.
H3C-
НзС
HC \
*СН2
CH3
C2H
2n5
CH3
CH2
O
12 C(O)OCH3 C(O)R
(Хл; R = -ОСН2СН=С(СНз)(СН2)з[СН(СНз)(СНз)з]2СН(СНз)2)
O
СНз
O
(МНХ)
ОН ОН (НАДФ)
Спектры оптического поглощения (200—900 нм) спектров поглощения проводили на основе раз-
регистрировали с помощью UV-VIS-спектрофо- ложения его на гауссовы составляющие. Реги-
тометра TU-1901 фирмы "Beijing Purkinje General страцию спектров флуоресценции в области 600—
Instrument Co, Ltd". Анализ плохо разрешенных 800 нм проводили с использованием спектрофлу-
878
ЛОБАНОВ и др.
X, нм
Рис. 1. Спектры поглощения системы Хл—НАДФ (Хл — раствор индивидуального хлорофилла); [Хл] = 1 х 10-5 М, [НАДФ]: 1 - 5 х 10-6, 2 - 1 х 10-5, 3 - 2.5 х 10-5, 4 - 5 х 10-5, 5 - 2.5 х 10-4, 6 - 5 х 10-4, 7- 5 х 10-3 М.
X, нм
Рис. 2. Спектры флуоресценции системы Хл-НАДФ; I - интенсивность люминесценции; [Хл] = 1 х 10-5 М; 1-7 - см. рис. 1.
ориметра "Флюорат-02 Панорама" фирмы "Люмэкс". Длина волны возбуждения составляла 430 нм. Все измерения проводили при комнатной температуре в стандартных кварцевых кюветах К10 с длиной оптического пути 1 см.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В водно-этанольной смеси (1 : 1) в структуре спектра поглощения Хл наблюдаются два основных максимума, соответствующие полосе Соре при 435 нм и 0-полосе при 668 нм (рис. 1). Учитывая данные о склонности Хл к образованию диме-ров и агрегатов [6], можно полагать, что доля не-
ковалентно связанных димеров Хл при используемой концентрации (1 х 10-5 М) не превышает 10%. Спектрального проявления таких димеров не наблюдается. В спектрах флуоресценции наблюдаются основная полоса эмиссии при 673 нм и плечо при 730 нм (рис. 2). Максимумы эмиссии при 673 и 730 нм соответствуют электронным переходам с уровня на уровень и его первый колебательный подуровень, что для соединений порфиринового ряда было установлено по определению разности между соответствующими уровнями в спектрах поглощения и флуоресценции по шкале частот Ау (в шкале энергий эта раз-
- л
Хл а
.....
1 1 1 1 1 1 1
0.001 0.002 0.003
0.004 0.005
с, моль/л
Рис. 3. Зависимости тушения флуоресценции хлоро-филлов а и Ь от концентрации НАДФ; ^ и я — площади под кривой спектра флуоресценции для раствора чистого хлорофилла и системы Хл—НАДФ соответственно.
ность составляет ~0.2 эВ) в интервале от комнатной до температуры жидкого азота [7]. Дополнительное подтверждение этого следует также из приблизительного равенства между временами жизни т для эмиссионных полос 673 и 730 нм, (различие ~5 нс). Добавление к раствору Хл в водном этаноле НАДФ до концентрации 5 х 10-4 М не приводит к изменениям в спектре поглощения Хл, однако интенсивность флуоресценции Хл изменяется самым существенным образом, уменьшаясь при увеличении концентрации НАДФ на порядок (рис. 2).
Известно, что тушение флуоресценции может иметь различные механизмы: перенос энергии, изменение внутримолекулярных констант, деградация электронного возбуждения, межмолекулярный перенос электрона [8]. В рассматриваемых растворах перенос энергии электронного возбуждения от Хл к НАДФ по синглетным уровням исключен, так как полоса поглощения НАДФ (максимум поглощения 260 нм, длинноволновый край поглощения 300 нм) лежит в более коротковолновой области по отношению к полосе флуоресценции Хл (рис. 1, 2). Наиболее вероятным механизмом тушения флуоресценции Хл в данном случае является перенос электрона между донором (возбужденной молекулой Хл) и акцептором электрона (НАДФ). В пользу этого предположения свидетельствует наличие линейного участка на зависимости Штерна—Фольмера снижения интенсивности флуоресценции Хл с ростом концентрации НАДФ в диапазоне от 5 х х 10-6—5 х 10—4 М (рис. 3).
Данные полярографического измерения потенциалов полуволн окисления Хл (ф°/2 = —1.14 В) и
восстановления НАДФ (ф$ = -0.32 В) дают возможность вычислить положение энергетического уровня Ер ион-радикальной пары, образуемой Хл и НАДФ после фоторазделения зарядов:
Ер = Ф1/2 - Ф1/2 - Еs, где Е8 — энергия сольватации ион-радикальной пары, которая зависит от радиуса ионов, расстояния между ними и диэлектрической проницаемости растворителя. Легко видеть, что энергия фотогенерации ион-радикальной пары меньше энергии синглетного возбужденного состояния Хл, составляющей 1.8 эВ, и, таким образом, термодинамически этот процесс возможен.
Наличие линейного участка на зависимости Штерна—Фольмера снижения интенсивности флуоресценции Хл с ростом концентрации нАдФ в диапазоне 5 х 10—6—5 х 10-4 М (рис. 3) и неизменность положения максимума полосы флуоресценции Хл в данных условиях (рис. 2) позволяют считать, что тушение флуоресценц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.