БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 5, с. 862-870
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 556.114; 577.34
ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ АНИОНОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ВОДЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕИОНИЗИР УЮЩИХ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
© 2014 г. С.В. Гудков* ** ***, В.Е. Иванов*, О.Э. Карп*, А.В. Черников*, К.Н. Белослудцев*, А.Г. Бобылёв*, М.Е. Асташев* ** ****, А.Б. Гапеев****, В.И. Брусков* **
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3; **Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290, Пущино Московской области, просп. Науки, 3; ***Институт общей физики им. А .М. Прохорова РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 38; **** Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской области, Институтская ул., 3
E-mail: s_makariy@rambler.ru Поступила в p едакцию 11.06.14 г.
Исследовано влияние биологически значимых анионов (сукцинат-, ацетат-, цитрат-, хлорид-, гидрокарбонат-, гидроортофосфат-, дигидроортофосфат-, нитрит-, нитрат-анионы) на процесс образования перекиси водорода и гидроксильных радикалов в воде под действием неиони-зирующих излучений: теплового, лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм, соответствующей максимуму поглощения молекулярного кислорода и электромагнитного излучения крайне высоких частот. Установлено, что различные анионы могут приводить как к ингиби-рованию процесса образования активных форм кислорода, так и к его увеличению. Гидрокарбонат- и сульфат-анионы, входящие в состав биологических жидкостей и лечебных минеральных вод, оказывают значительное, но противоположное друг другу влияние на продукцию активных форм кислорода, гидрокарбонат-анион является прооксидантом, сульфат-анион -анитиоксидантом. Рассмотрены различные молекулярные механизмы образования активных форм кислорода под влиянием исследованных излучений с участием данных анионов, которые могут влиять на биологические процессы сигнально-регуляторным способом и оказывать лечебное воздействие при физиотерапевтических процедурах.
Ключевые слова: биологически значимые анионы, перекись водорода, гидроксильные радикалы, лазерное, тепловое и электромагнитное излучение крайне высоких частот, образование активных форм кислорода в воде.
Среди веществ, присутствующих в любом организме, включая человека, вода составляет наибольшую часть. Причем необходимым является ее постоянное поступление и обновление в ор ганизме. Под воздействием различных физических факторов среды в воде образуются активные формы кислорода (АФК), которые играют в организме млекопитающих двоякую роль. С одной стор оны, они пр иводят к окислительным повреждениям биомолекул [1-3], с другой - являются важными сигнально-регуля-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода, ДТНБ -реактив Эллмана, 7-ОН-ККК - 7-гидроксикумарин-3-кар-боновая кислота, ТНБ - 5-тио-2-нитробензойная кислота, ОВП - окислительно-восстановительный потенциал.
торными молекулами [4,5]. Ранее в наших работах показано, что такие физические факторы, как тепловое воздействие [6,7], видимый свет [8,9], инфракрасное излучение [10], электромагнитное излучение крайне высоких частот [11] также приводят к образованию АФК. Ключевым этапом в процессах образования АФК под действием неионизирующих факторов является переход кислорода в синглетное состояние и восстановление синглетного кислорода до супероксид анион-радикала. Для этого необходимо присутствие в среде доноров электронов. П ринято считать, что донор ами электр онов в биологических системах являются преимущественно катионы металлов переменной валентности, такие как железо, медь и др. [12]. Однако
в воде, насыщенной атмосферными газами, донорами электронов могут выступать некоторые биологически значимые анионы в результате обр азования электрон-радикальных пар при определенны х воздействиях. Основные биологически значимые неорганические анионы плазмы крови человека аналогичны анионам морской воды [13], ими являются хлорид- (0,1 М - плазма крови, 0,53 М - морская вода) и гидрокарбонат-анионы (27 мМ - плазма крови, 2,3 мМ -морская вода). В морской воде наряду с хлор иди гидрокар бонат-анионами присутствуют в достаточно больших концентрациях сульфат-анионы (до 30 мМ) [14], в кр ови - гидроортофосфат-и дигидроортофосфат-анионы (1-2 мМ) [15]. К биологически значимым анионам относятся нитрит- и нитрат-анионы, которые образуются в результате окисления эндогенного NO и ряда других процессов, а также поступают в организм животных и человека с пищей и водой [16], в растения - с водой [17]. Также биологически значимыми анионами являются анионы органических кислот, участвующих в биоэнергетических циклах [18]. Все биологически значимые анионы, кр оме хлорид-аниона, в биологических жидкостях имеют концентрации около 1 мМ или менее, поэтому сравнение эффектов анионов проводилось при одной концентрации 1 мМ.
В данной работе исследована эффективность влияния биологически значимых анионов на генерацию активных форм кислорода в воде под действием таких неионизирующих физических факторов, как тепло, электромагнитное излучение крайне высоких частот и лазерное излучение с длиной волны 632,8 нм, соответствующей максимуму поглощения молекулярного кислорода. Полученные результаты показывают, что различные анионы по-разному влияют на образование таких активных форм кислорода, как перекись водорода и гидро-ксильные радикалы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В работе использовали следующие соли: NaCl (ACS Grade, АррИСЬеш, Германия), NaHCO3, ^2НР04-2Н2О и ^Н2Р04-2Н2О (ACS Grade, Amreso, США), Na лимонно-кис-лый 3-замещенный, Na лимонно-кислый, Na сукцинат, Na ацетат, Na малонат, Na фумарат, Na малат, Na лактат, NaN03, NaN02, Na2S04 (ACS Grade, Sigma-Aldridi, ОТА). В работе использовали также перекись водорода (Хим-Мед, Россия), тритон Х-100, трис(гидроксиме-тил) аминометан, 4-йодофенол, кумарин-3-кар-боновую кислоту, 7-ОН-кумарин-3-карбоновую
кислоту, 5,5-дитиобис(2-нитробензойную кислоту) (реактив Эллмана, ДТНБ) (Sigma-Aldrich, США), люминол (AppliChem, Германия). Би-дистиллированная вода была насыщена атмосфер ным воздухом в течение суток, имела рН 5,6 и удельную электр опроводность 120 мкСм/м. Концентр ация молекулярного кислор ода в воде составляла 270 мкМ. Чтобы исключить возможность влияния следовых количеств металлов, потенциально содержащихся в солях, на процессы генерации АФК, ряд экспериментов проводили с нерастворимым хелато ром катионов переменной валентности Che^-lOO (BioRad, Великобритания). Измерение окислительно-восстановительного потенциала проводили на приборе Эксперт-001 (Эконикс, Россия) с электродом ЭПВ-1СР (Эконикс, Россия).
Воздействие неионизирующих физических факторов. Облучение воды и водных растворов проводили гелий-неоновым лазером ЛГН 208А (МедАппаратура, Россия) с излучением при 632,8 нм. П ри мощности лазера 1,7 мВт плотность потока составила 70 мВт/см2 [19]. Дозиметрию лазерного излучения проводили с помощью пр ибора Field Master (Coherent, США). Облучение растворов проводили во флаконах из полипропилена (Beckman, США)
Тепловое воздействие осуществляли прогреванием р астворов во флаконах из полипропилена в ультратермостате MO1 (Termex, Ро ссия) при разных температур ах (с точностью до ± 0,1 градуса) в течение различных временных интервалов.
И сточником ЭМИ КВЧ служил высокочастотный генератор Г4-141 (И сток, Ро ссия). Облучение образцов проводили в дальней зоне пир амидальной рупорной антенны с апертурой 32 х 32 мм. Дозиметрические процедуры про -водили в условиях холостого хода антенны. В экспериментах использовали следующие пара -метры воздействия ЭМИ КВЧ - несущая частота 42,2 ГГц, плотность потока мощности 100 мкВт/см2, длительность экспозиции 20 мин, импульсная модуляция меандр с частотой 16 Гц. Облучение растворов проводили во флаконах из полипропилена (Beckman, США).
Определение концентрации перекиси водорода. Концентрацию перекиси водорода определяли методом усиленной хемилюминесценции в системе люминол-4-йодофенол-пероксидаза хрена [20]. В качестве хемилюминометра использовали жидкостный сцинтилляционный счетчик «Бета-1» (МедАппаратура, Украина) для измер ения ß-излучения, работающий в р е-жиме счета одиночных фотонов (без схемы совпадений) [21]. Непосредственно перед измере-
Таблица 1. Образование перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах различных анионов (1 мМ), подвергнутых действию тепла
Анионы Д[Н 2О2], нМ К ** Д[*ОН], нМ К **
Н 2О контроль 3,9 ± 0,3 1,0 13,4 ± 1,1 1,0
Сукцинат 1,4 ± 0,3* 0,3 9,2 ± 1,0* 0,7
Ацетат 1,3 ± 0,1* 0,3 12,4 ± 0,4 0,9
Цитрат 1,9 ± 0,1* 0,5 15,6 ± 1,4 1,2
Фумарат 2,1 ± 0,2* 0,5 н/д -
Малат 3,7 ± 0,3 0,9 н/д -
Лактат 3,4 ± 0,2 0,9 н/д -
Малонат 3,8 ± 0,2 1,0 н/д -
Хлорид 4,2 ± 0,3 1,0 13,4 ± 0,9 1,0
Гидрокарбонат 5,2 ± 0,6* 1,3 25,6 ± 2,0* 1,9
Дигидроортофосфат 2,6 ± 0,2* 0,7 20,8 ± 1,7* 1,5
Гидроортофосфат 2,3 ± 0,2* 0,6 17,8 ± 1,0* 1,3
Нитрит 4,8 ± 0,5* 1,2 34,0 ± 2,9* 2,5
Нитрат 3,0 ± 0,2* 0,8 10,6 ± 2,3 0,8
Сульфат 1,9 ± 0,2* 0,5 9,9 ± 0,6* 0,7
Примечание. Представлены средние значения и величины стандартных ошибок, п = 3. * - Данные, статистически отличные от контроля (р < 0,05). ** - Относительное изменение величины образования перекиси водорода или гидроксильных радикалов при действии тепла в присутствии и отсутствии изучаемого аниона.
нием содержания Н2Ог к образцам добавляли по 0,5 мл «счетного раствора», содержащего: 10 мМ трис-HCl буфер (рН 8,5), 50 мкМ 4-йодфенола, 50 мкМ люминола и пероксидазу хрена. Концентрацию Н2О2 рассчитывали используя калибровочные графики зависимости интенсивности хемилюминесценции образцов от содержания добавленной перекиси водор ода известной концентрации. И сходную концентра -цию Н 2О 2 для калибровки опр еделяли спектро -фотометрически при длине волны 240 нм с использованием коэффициента молярного поглощения 43,6 М-1-см-1. Чувствительность метода позволяет определять Н 2О 2 в концентра -ции 0,1 нМ [6].
Определение концентрации гидроксильных радикалов. Определение концентрации гидро-ксильных радикалов осуществляли с помощью реакции этих радикалов с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.