ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2014, том 88, № 2, с. 351-354
^=БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК: 544.72.05+53.086
ВЛИЯНИЕ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА НА СТРУКТУРУ И СВОЙСТВА ПЛЕНОК ЛЕНГМЮРА-БЛОДЖЕТТ НА ОСНОВЕ ФОСФОХОЛИНА И ХОЛЕСТЕРИНА © 2014 г. Е. И. Дубатовка, Г. К. Жавнерко, В. Е. Агабеков
Национальная академия наук Беларуси, Институт химии новых материалов, Минск
E-mail: d_katerina@tut.by Поступила в редакцию 04.05.2013 г.
Моно- и бислойные пленки Ленгмюра—Блоджетт на основе фосфохолина и холестерина, выделенные методами горизонтального и вертикального осаждения, изучены методом атомно-силовой микроскопии. Установлено, что бычий сывороточный альбумин (БСА) включается в состав пленок на стадии их формирования; при этом метод выделения оказывает существенное влияние на их структуру. Показано, что в результате переноса липидов на гидрофобную поверхность с субфазы, содержащей БСА, происходит образование глобулярных наноразмерных структур высотой 4—7 нм, свидетельствующее о реорганизации монослоя в процессе выделения и включении белка в его состав.
Ключевые слова: липосомы, липиды, пленки Ленгмюра—Блоджетт, атомно-силовая микроскопия.
Б01: 10.7868/80044453714020071
Липосомы — один из наиболее исследованных классов частиц, которые рассматриваются как современные и эффективные средства внутривенной доставки лекарственных препаратов, применяющихся в клинической практике [1]. Они представляют собой сферические многослойные организованные системы, состоящие из концентрических липидных бислоев (стенок), толщина которых определяется прежде всего длиной углеводородных цепей и обычно варьирует в пределах 4—7 нм [2]. Актуальной задачей является формирование липосом из липидов клеточной мембраны (фосфолипиды, гликолипиды и холестерин), а также повышение их устойчивости в кровотоке при внутривенном введении [3].
Свойства стенок липосом из фосфохолина и холестерина изучали на примере соответствующих бислойных мембран, формируемых на плоской поверхности за счет разворачивания везикул из раствора [4] или методом Ленгмюра—Блоджетт (ЛБ) [5—7]. Клеточные стенки функционально активны за счет присутствия белков [2], поэтому важной задачей является исследование их влияния на формирование моно- и бислоев липидов. Показано [5], что белок (щелочная фосфатаза) слабо адсорбируется на липидном монослое ди-пальмитоилфосфохолин/холестерин. Однако при использовании технологии ЛБ для переноса сформированных на водной поверхности пленок может происходить взаимодействие белка и ли-
пидов, приводящее к образованию структуры, сходной со строением стенок липосом.
Цель работы состояла в оценке влияния бычьего сывороточного альбумина (БСА) на структуру, свойства и особенности формирования липидных пленок на основе 1, 2-дистеароил-жп-гли-церо-3-фосфохолина (ДСФХ) и холестерина (ХС), сформированных на кремниевой поверхности методом Ленгмюра—Блоджетт [6].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Изотермы сжатия липидных монослоев и формирование пленок на твердой поверхности снимали на экспериментальной установке ЛТ-103 (ОДО "Микротестмашины", Беларусь, г. Гомель). Для этого индивидуальные вещества ДСФХ (99%, "Sigma"), ХС (95%, "Acros Organics") и их композицию (молярное соотношение компонентов 2:1), наносили на водную поверхность из раствора в хлороформе. Сжатие монослоя и запись изотермы начинали спустя 5—7 мин после испарения растворителя. Мономолекулярный слой смеси липидов (ДСФХ : ХС = 2 : 1 мол.) формировали на гидрофильных кремниевых подложках методами горизонтального (ГО) и вертикального (ВО) осаждения [6, 8]. Бислойные пленки получали методом ВО на гидрофобной поверхности кремния. Оптимальные параметры выделения пленок выбирали, исходя из данных зависимостей поверхностного давления п от площади, приходящейся
352
ДУБАТОВКА и др.
п, мН/м
70 2
60 - \
50 Г"~л
40 -Л —Л \
30 \ I,
20 - \
10 - \
0
0.7
0.9 A, нм2
Рис. 1. п — А — изотермы ХС (1), ДСФХ (2), ДСФХ:ХС (2:1) (3), полученных на водной субфазе и ДСФХ:ХС (2:1) (4) — на субфазе, содержащей бСа (10—4 моль/л); п — поверхностное давление, А — площадь, приходящаяся на одну молекулу в монослое.
на одну молекулу в монослое (А) чистых липидов и их смеси.
В качестве подложек для выделения пленок использовали кремниевые пластины прямоугольной формы площадью ~2 см2, которые предварительно гидрофилизировали при 320 К в течение 15 мин в смеси Н20^Н40Н:Н202 в соотношении
5:1:1 по объему. Для получения гидрофобного слоя их модифицировали 0.01 М раствором окта-децилтрихлорсилана (ОТС) в смеси CCl4 : гекса-декан (1 : 4) при слабом нагреве (300—310 К) в течение 25 мин, затем промывали и высушивали.
Особенности рельефа и морфологию сформированных покрытий изучали с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ, Nanoscope-3D, Vee-co, USA) в контактном режиме. Использовали кантилеверы из нитрида кремния с константами жесткости 0.06, 0.12 и 0.32 Н/м, скорость сканирования составляла 3—5 Гц, плотность информации — 512 х 512 точек. АСМ изображения обрабатывали при помощи программного обеспечения "Nanoscope 5.31r1".
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Из изотерм сжатия индивидуальных веществ (ДСФХ и ХС) и их смеси (рис. 1) следует, что давление коллапса для монослоев ДСФХ и ХС составляет 72 и 38 мН/м соответственно. Площадь, приходящаяся на одну молекулу в плотноупако-ванном слое (А0) фосфохолина — 0.47, холестерина -0.38 нм2. Вид п — А изотерм смеси ДСФХ и ХС (2:1) (рис. 1) указывает на наличие двух фазовых переходов. Первому, при давлении 5—8 мН/м, по-видимому, соответствует процесс переориентации липидов в монослое; второму (при 40 мН/м) — переход из жидко-растянутого состояния в твер-
(a)
0.859 нм 1.002 нм 0.951 нм
-4'
нм 4
-4
j
10
(б)
2.709 нм
20 мкм
к. J У
2.815 нм
■f
Н/
f
10
20 мкм
0
Рис. 2. АСМ-изображения и профили поверхности пленок из смеси липидов ДСФХ : ХС = 2:1, выделенных на гидрофильной кремниевой подложке методом ГО при поверхностном давлении 10 мН/м с водной поверхности (а) и субфазы, содержащей БСА (10—4 моль/л) (б).
ВЛИЯНИЕ БЫЧЬЕГО СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА
353
дое. Давление, при котором протекает второй фазовый переход в смеси липидов на 5—7 мН/м выше по сравнению с чистым ДСФХ (35 мН/м). Кроме этого, присутствие холестерина в составе монослоя приводит к уменьшению посадочной площадки молекул с 0.47 до 0.45 нм2. Это свидетельствует о взаимодействии между молекулами, приводящем, по-видимому, к формированию доменных структур с высокой упорядоченностью монослоя. Липиды в составе стенок липосом находятся в состоянии, соответствующем жидко-растянутой пленке на поверхности, поэтому формирование моно- и бислоев липидов на кремниевой подложке проводили при давлении 10 мН/м.
Методом АСМ исследованы пленки из смеси ДСФХ и ХС, выделенные горизонтальным методом на гидрофильной подложке. Как следует из топографического изображения (рис. 2а), липиды в составе монослоя находятся в двух фазовых состояниях: "твердая пленка", состоящая из высо-коупорядоченных областей (доменов), и "жидко-растянутая пленка".
Из изотерм сжатия смеси ДСФХ : ХС на водной поверхности и на субфазе, содержащей бычий сывороточный альбумин (рис. 1), следует, что при формировании монослоя с белком эффективная посадочная площадка липидной смеси увеличивается с 0.45 до 0.49 нм2. Это свидетельствует о включении БСА в монослой за счет бе-лок-липидных взаимодействий.
Морфология пленок смеси липидов, выделенных методом ГО с водной поверхности и субфазы, содержащей БСА, различна (рис. 2). Перепад высот между двумя фазовыми состояниями монослоя в первом случае составляет порядка 1 нм (рис. 2а), а во втором — 2.5—3 нм (рис. 2б), что превышает длину "хвостов" молекул липидов (1—2 нм). Следовательно, белок даже в малых концентрациях встраивается в пленку и стабилизирует ее.
Перенос молекул липидов с водной поверхности на гидрофильную кремниевую подложку осуществляли также вертикальным методом. В этом случае происходит формирование мономолекулярной пленки (рис. 3). При осаждении липидов из субфазы, содержащей БСА, образуется три типа структур (рис. 3а). Основная часть монослоя, представленная на изображении трения в виде светлого тона, состоит, по-видимому, из фосфо-холина и холестерина в состоянии "твердая пленка". Более темные участки поверхности округлой формы являются смесью ДСФХ и ХС в состоянии "жидко-растянутая" пленка. Высота между фазами порядка 1—1.5 нм, что согласуется с толщиной монослоя, полученного на субфазе, не содержащей белка (рис. 2а). В данном случае БСА практически не встраивается в пленку липида, а находится на поверхности со стороны полярных "головок" молекул, а отдельные глобулы высотой 3—
(а)
0 5 мкм 0 5 мкм
(б)
0 5 мкм 0 5 мкм
Рис. 3. АСМ-изображения поверхности пленок ДСФХ : ХС (2:1), выделенных методом ВО при поверхностном давлении 10 мН/м на гидрофильной (а) и гидрофобных (б, в) кремниевых подложках. Субфаза — дистиллированная вода (б), БСА — 10-4 моль/л (а, в). Изображения в режиме высоты приведены слева, в режиме трения — справа.
7 нм, по-видимому, представляют собой бислой-ные агрегаты.
Липиды в составе липосом находятся в виде бислоя, поэтому для формирования модели оболочки (пленка Y-типа) на твердой поверхности использовали гидрофобные подложки и вертикальный метод выделения [6]. Для получения такой структуры первоначально формировали монослой из молекул липида погружением подложки, а затем наносили второй слой при ее поднятии. В этом случае морфология пленок смеси ДСФХ и ХС существенно изменилась по срав-
354
ДУБАТОВКА и др.
нению с аналогичными покрытиями на гидрофильной поверхности (рис. 3б, в). При формировании липидных структур из воды они имеют форму диска (соотношение их диаметра к высоте составляет 55:1). Перепад высот в пленке при этом составляет 1.8—2.2 нм (рис. 3б). Анализ изображений в режиме трения практически не выявил неоднородностей фазового контраста, что свидетельствует об одинаковом качественном составе сформированного монослоя и липидных агрегатов.
При выделении пленки с субфазы, содержащей БСА (10—4 моль/л), также образуются липид-ные структуры высотой 4—7 нм, равномерно рас
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.