ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2011, № 1, с. 61-67
ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
УДК 597.554.3-169-7-51+577.15
ВЛИЯНИЕ Caryophyllaeus laticeps (Cestoda, Caryophyllidea) НА АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ЛЕЩА
© 2011 г. Г. И. Извекова*, М. М. Соловьев**, Е. И. Извеков*
*Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742Ярославская обл., Некоузский р-н, пос. Борок **Институт систематики и экологии животных СО РАН, 630091 Новосибирск, ул. Фрунзе, 11
E-mail: izvekov@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 11.05.2010 г.
Проведены сравнительные исследования активности основных пищеварительных гидролаз у леща, зараженного и не зараженного цестодами Caryophyllaeus laticeps (Pallas, 1781). Показан неравномерный характер распределения активности ферментов и существование градиентов активности про-теаз и липазы вдоль кишечника. При заражении леща цестодами понижается активность исследованных ферментов и изменяется процентное соотношение активности различных подклассов про-теиназ. Не обнаружено связи между распределением червей вдоль кишечника и уровнями активности пищеварительных гидролаз.
У рыб, как и у всех позвоночных животных, способность утилизировать перевариваемую пищу зависит от присутствия пищеварительных ферментов, характеризующихся определенной локализацией в стенке и вдоль просвета кишечного тракта. Как правило, распределение и уровень активности этих ферментов вдоль кишечника рыб варьируют в зависимости от типа питания и морфологии кишечника (Уголев, Кузьмина, 1993). Поскольку общих закономерностей в распределении пищеварительных ферментов вдоль желудочно-кишечного тракта рыб не установлено, интерес к исследованию градиентов их активности не ослабевает (Deguara et al., 2003; Lund-stedt et al., 2004; Sklan et al., 2004).
Распределение ферментов в слизистой оболочке кишечника рыб неравномерно. Описаны как проксимо-дистальные, так и радиальные градиенты активности различных гидролаз. Многочисленные сведения о градиентах различных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб одного вида, а также о распределении активности одного и того же фермента у рыб разных видов в значительной мере противоречивы (Уголев, Кузьмина, 1993). В то же время отмечены и некоторые закономерности в существовании градиентов. Так, мембранный гидролиз жиров осуществляется главным образом в проксимальном отделе кишечника и пилорических придатках, а гидролиз углеводных и белковых компонентов пищи — в медиальном и дистальном отделах кишечника (Кузьмина, 2005).
Одним из факторов, влияющих на уровень активности пищеварительных ферментов, может быть заражение паразитами, и в частности цесто-дами. Работы о влиянии паразитов на активность
пищеварительных ферментов хозяев немногочисленны, а приведенные в них сведения противоречивы. Заражение паразитами может ограничивать возможности приема пищи у хозяев, что влечет за собой изменение каталитической способности ферментов кишечника (Куровская, 1991).
Так, отмечено снижение сахаразной активности в слизистой оболочке кишечника крыс при паразитировании Nippostrongylus brasiliensis, Eimeria nieschulzi или совместной инвазии этих паразитов (Mayberry et al., 1986). Показано, что кишечные градиенты глюкозы, углеводов, аминокислот, белка и липидов у крыс, питающихся ad libitum, сильно отличаются у зараженных Hy-menolepis diminuta и здоровых животных (Mettrick, 1971). Степень наблюдаемых различий свидетельствует о реальной конкуренции между хозяином и паразитом за питательные вещества (Mettrick, Podesta, 1974).
В то же время обнаружено, что активность трипсина и общая протеолитическая активность (Pappas, 1978), также как распределение амилазы (Mead, 1976), у инфицированных H. diminuta и здоровых крыс не различаются. Установлено, что присутствие H. diminuta не влияло на скорость прохождения пищи по кишечнику, однако усвоение крахмала из жидкой пищи было выше у зараженных крыс по сравнению с незараженными. При кормлении хозяев твердой пищей влияние червей было минимальным (Mead, Roberts, 1972).
Аналогичные исследования, проведенные на рыбах, единичны. В этих работах показано снижение активности амилазы, протеазы и кислой фосфатазы в слизистой и содержимом кишечника сеголеток карпов при заражении Bothriocep-
halus acheilognathi (Давыдов, Куровская, 1991; Ку-ровская, 1991).
С целью анализа межвидовых отношений в сообществе гельминтов исследуется их распределение по пищеварительному тракту хозяев, и в частности рыб, однако без специального акцента на активность пищеварительных гидролаз (Жохов, 2004). Цестоды Caryophyllaeus laticeps — доминирующий вид паразитических червей в кишечнике леща (Жохов, Фрезе, 2004). Не все участки кишечника в равной степени доступны или подходят для обитания гельминтов, однако причины этого не всегда очевидны. Вдоль пищеварительного тракта описаны различия в строении мускулатуры кишечных стенок, структуре поверхности слизистой и ее физико-химических свойств (Уго-лев, Кузьмина, 1993), содержании питательных веществ в химусе (Кузьмина и др., 2008), активности пищеварительных ферментов (Deguara et al., 2003; Lundstedt et al., 2004; Sklan et al., 2004). Все эти различия могут влиять на распределение гельминтов вдоль кишечника.
Цель работы — изучение распределения активности различных пищеварительных ферментов вдоль кишечника леща, установление степени влияния заражения цестодами C. laticeps на уровень активности этих ферментов, а также исследование связи между распределением червей вдоль кишечника и активностью пищеварительных гидролаз.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служил лещ Abramis brama (Linnaeus, 1758), не зараженный и зараженный цестодами C. laticeps (Pallas, 1781). Лещ отловлен в июле—августе 2009 г. в Рыбинском водохранилище. Длина исследованных особей (по Смитту) колебалась от 355 до 405 мм. У рыб извлекали кишечник, вскрывали, удаляли химус, затем делили кишечник на 7 отделов по 4—5 см длиной. У зараженных рыб подсчитывали количество червей в каждом отделе. Из слизистой каждого отдела готовили гомогенат. Для этого к навеске слизистой добавляли 1 мл 0.1 М трис-НС1 буфера (рН 8.5), центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин, супернатант сливали в новую пробирку, к осадку добавляли еще 0.5 мл буфера, повторно гомогенизировали и центрифугировали. После этого оба супернатанта объединяли и определяли активность пищеварительных ферментов. Суммарную активность протеиназ (активность трипсина КФ 3.4.21.4, химотрипсина КФ 3.4.21.1 и ди-пептидаз КФ 3.4.13.1—3.4.13.11) определяли с использованием 0.3%-ного азо-казеина (Sigma, США, № 11610-10G) в качестве субстрата (Alar-con et al., 2002). Для идентификации различных подклассов протеиназ применяли ингибиторы: PMSF (фенил-метил-сульфонил-флуорид) — ин-
гибитор сериновых протеиназ, в концентрации 100 мМ в DMSO (диметилсульфоксид); EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) — ингибитор металлопротеаз, в концентрации 0.5 М в 1 М NaOH и Е-64 — ингибитор цистеиновых (тиоловых) протеиназ, в концентрации 1 мМ в дистиллированной воде. Активность амилазы (КФ 3.2.1.1) определяли методом Бернфелда (Deguara et al., 2003) с 1%-ным растворимым крахмалом в качестве субстрата. Активность липазы (неспецифические липазы КФ 3.1.1) определяли методом (Gawlicka et al., 2000) с 0.4 мМ п-нитрофенилмиристатом в качестве субстрата. Активность эстераз (неспецифические эстеразы КФ 3.1.1) определяли с 0.27 мМ п-нитрофенилацетатом (Sigma № N-8130) в качестве субстрата (Prabhakaran, Kamble, 1995). Субстраты для определения общей протеолити-ческой активности и активности а-амилазы готовили на 0.1 М трис-HCL буфере (рН 8.5), для определения активности неспецифических эсте-раз — на 0.1 М фосфатном буфере (рН 8.5), для определения активности липазы использовали 24 мМ (NH4)2CO3 (рН 8.5) с добавлением 0.5% тритона Х-100 в качестве детергента. Интенсивность развивающегося окрашивания, пропорционального активности ферментов, измеряли на спектрофотометре СФ-46 (Россия). Активность исследованных ферментов выражали в условных единицах, усл. ед. (разность показаний спектрофотометра пробы с субстратом и холостой пробы на грамм влажной навески слизистой кишечника за минуту).
Результаты представлены в виде средних и их ошибок, для определения достоверных влияний использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, пакет Statistica 6.0). Переменными служили показатели ферментативной активности, а факторами — порядковые номера особей и отделов кишечника, а также наличие паразитов в этих отделах.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Установлено, что вдоль кишечников зараженных лещей цестоды распределяются неравномерно (рис. 1). В 1-м отделе кишечника черви отсутствуют, наибольшее их количество обнаружено в 3-м и 4-м отделах.
Активность пищеварительных гидролаз проявляется на всем протяжении кишечника, как у зараженных, так и у незараженных особей (рис. 2, 3). При этом активность различных ферментов распределяется вдоль кишечника по-разному. Так, наибольшая общая протеолитическая активность у незараженных лещей обнаружена в 5-6-м отделах, от 1-го к 5-му отделу она увеличивается с 0.155 ± 0.031 до 0.427 ± 0.075 усл. ед. (рис. 2а). Более высокая активность амилазы у незараженных лещей отмечена в 3-м и 7-м отделах (0.1 ± 0.074 и 0.104 ± 0.012 усл. ед. соответственно), а самая низ-
Число червей 12 г
10 -
8 -
6 -
4 -
2 - 1 —
0-—-—-—-—-—---
1 2 3 4 5 6 7
Отдел кишечника
Рис. 1. Распределение С. laticeps вдоль кишечника леща.
кая - во 2-м (0.046 ± 0.014 усл. ед.) (рис. 2б). Активность липазы возрастает от 1-го (0.237 ± 0.043 усл. ед.) к 5-му отделу (0.605 ± 0.113 усл. ед.) и несколько снижается в 6-м и 7-м отделах (рис. 3а). Активность эстераз на протяжении всего кишечника колеблется в небольших пределах (0.23 ± ± 0.042-0.38 ± 0.126 усл. ед.) и несколько увеличивается в 7-м отделе (0.51 ± 0.07 усл. ед.) (рис. 3б).
Прослеживается тенденция к уменьшению активности пищеварительных гидролаз в большинстве отделов при заражении леща цестодами C. 1а-ticeps (рис. 2, 3). Однако связи между распределением червей вдоль кишечника и уровнями активности п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.