РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 3-4, с. 338-342
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
ВЛИЯНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ТРОФОБЛАСТИЧЕСКОГО в 1-ГЛИКОПРОТЕИНА НА СТИМУЛИРОВАННУЮ ЛЮМИНОЛЗАВИСИМУЮ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ ЛЕЙКОЦИТОВ
© 2009 г. С.В. Слободчикова, К.В. Шмагель, М.Б. Раев, Б.А. Бахметьев
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Поступила: 03.07.2009. Принята: 05.08.2009
Проведено исследование влияния человеческого трофобластического в1-гликопротеи-на на стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов. Троф-областический р1-гликопротеин выделяли из сыворотки крови беременных женщин по оригинальной методике. Его эффект исследовали на лейкоцитах периферической крови здоровых мужчин. Показано выраженное подавляющее действие белка беременности на стимулированную опсонизированным и неопсонизированным зимозаном люминолзави-симую хемилюминесценцию лейкоцитов. Эффект белка имел концентрационную зависимость.
Ключевые слова: трофобластический р1-гликопротеин, ТБГ, полиморфноядерные лейкоциты, свободные радикалы, хемилюминесценция
Трофобластический в 1-гликопротеин (ТБГ) — один из специфических белков беременности, образующийся в плаценте. Он был открыт Ю.С. Татариновым в 1970 г. [1]. При изучении иммуномодулирующих свойств протеина была установлена его способность подавлять пролиферативный ответ митогенстимулированных лимфоцитов [2], снижать продукцию фактора, ингибирую-щего миграцию макрофагов [3, 4], вызывать их альтернативную активацию [5], усиливать генерацию Кон-А-зависимых Т-супрессоров [6]. Через макрофаги ТБГ способен снижать уровень Th1 адаптивного ответа [7]. Он также блокирует процесс дегрануляции тучных клеток [8].
Однако до сих пор не было исследовано влияние ТБГ на кислородзависимую бактерицидную функцию фагоцитов. При этом следует отметить, что рецепторы к этому протеину обнаружены на поверхности нейтро-филов [9]. Целью данной работы была оценка эффектов ТБГ in vitro при его воздействии на стимулированную люминолзависимую хемилюминесценцию (ЛЗХЛ) лейкоцитов.
Адрес: 614081, г. Пермь, ул. Голева 13. E-mail: ecolimmlab@yandex.ru
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение ТБГ. ТБГ получали методом им-мунопурификации с использованием биоспецифического сорбента с последующим освобождением от иммуноглобулиновой контаминации на сорбенте С-белок-сефа-роза РР («Ате^ат», США) [10]. В качестве биоспецифического сорбента использовали сефарозу СЬ 4В, гранулы которой конъю-гировали с моноклональными антителами к ТБГ, продуцируемыми гибридомой ВАР3 («Сепоуае», Германия). Предварительно от-центрифугированную при 25000 д сыворотку крови беременных женщин со сроками беременности свыше 36 недель смешивали с сорбентом и инкубировали в течение 36 — 48 часов при +4 °С. Сорбент переносили в колонку, отмывали фосфатно-солевым буфером с рН 7,25 до нулевых значений оптической плотности. Элюцию осуществляли 0,1 М глицин-НС1 буфером с рН 2,6. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно подвергали концентрирующей диафильтрации против физиологического раствора, после чего проводили негативную хроматографию на сорбенте С-белок-сефа-роза РР. Полученный препарат концентрировали до 1 мг/мл.
Подготовка неопсонизированного зимоза-на. К 75 мг зимозана добавляли 5 мл физиологического раствора, кипятили на водяной бане 30 мин и перемешивали на магнитной мешалке 10 часов. Двукратно отмывали центрифугированием (350 g; 15 мин) и ресуспен-дировали осадок в 5 мл физиологического раствора. Полученную суспензию зимозана (15 мг/мл) разливали на аликвоты и замораживали при —20 °С.
Опсонизация зимозана. К суспензии зимозана с концентрацией 1,5 мг/мл в изотоническом растворе хлорида натрия добавляли равный объем свежей пулированной сыворотки здоровых доноров и инкубировали 30 мин при 37 °С, периодически встряхивая. После трехкратного отмывания центрифугированием (350 g; 15 мин) в физиологическом растворе частицы зимозана ресуспендировали до исходного объема, разливали на аликвоты и замораживали при —20 °С.
Забор крови. Забор венозной крови производили у 14 условно здоровых добровольцев-мужчин в возрасте от 24 до 55 лет. В первой серии экспериментов обследовано 3, во второй — 11 человек. Образцы крови помещали в стеклянные пробирки с раствором гепарина (ОАО «Синтез», г. Курган) в концентрации 25 ЕД на 1 мл.
Подготовка клеток. Исследования проводили с неотмытыми и отмытыми лейкоцитами крови. В первой серии экспериментов взвесь лейкоцитов получали после естественного оседания форменных элементов цельной крови при 37°С в течение 0,5 — 1 часа. Собирали верхний слой плазмы, содержащий лейкоциты. В камере Горяева подсчитывали количество сегментоядерных клеток. Концентрацию последних доводили до 106 кл/мл раствором Хенкса (без фенолового красного, ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Екатеринбург). В другой серии экспериментов клетки два раза отмывали от плазмы раствором Хенкса (центрифугирование при 350 g; 15 мин; +4 °С), ресуспендировали до 106 кл/ мл по числу полиморфноядерных лейкоцитов, хранили на льду до исследования. Суспензии зимозана («Sigma», США), растворы соответствующих концентраций ТБГ, человеческого сывороточного альбумина (НПО «Биомед», г. Пермь) и люминола («Fluka», Швейцария) готовили на растворе Хенкса.
Исследование хемилюминесценции. Суспензии лейкоцитов, как неотмытых, так и отмытых, вносили по 10 мкл в лунки микро-
планшета, содержащие люминол (10 мкмоль), зимозан, ТБГ, и немедленно начинали измерение люминесценции. Опсонизированный зимозан (ОЗ) использовали в концентрациях 0,15, 0,015, 0,0015 и 0 мг/мл, неопсонизирован-ный (НЗ) — в концентрациях 0,15 и 0 мг/мл. Конечное содержание ТБГ в пробах составляло 0, 10, 50 и 200 мкг/мл. В качестве контроля использовали человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) в тех же концентрациях. Общий объем измеряемой пробы составлял 100 мкл. Исследования выполняли в трех по-вторностях.
Измерение люминесценции проводили при 37 °С в течение 1 часа в динамическом режиме на микропланшетном люминомет-ре «Luminoskan Ascent» («Thermo Electron Corporation», Финляндия). Интервал между замерами составлял 3 мин. Полученные результаты обрабатывали с помощью прилагающегося к прибору программного обеспечения «Ascent Software». Вычисляли площадь под кривой люминесценции. Результат выражали в виде интегральных значений relative luminescence light units (RLU). Статистическую обработку результатов проводили с использованием факторного анализа и парного t-критерия Стьюдента [11]. Силу влияния факторов оценивали по Плохинскому [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии экспериментов определяли влияние различных концентраций ТБГ на стимулированную ЛЗХЛ лейкоцитов в присутствии аутоплазмы. В качестве стимулятора использовали ОЗ в разных дозировках. В этой модели (активации лейкоцитов зимозаном без добавления тестируемых белков) средний уровень ЛЗХЛ при внесении стимулятора в концентрации 0,15 мг/мл составил 2024 RLU (рис. 1, A). Хемилюминесценция отдельных компонентов реакционной смеси (лейкоцитов без стимулятора, протеинов и зимоза-на) в присутствии люминола не превышала 11,5 RLU. Для оценки эффектов ТБГ параллельно исследовали влияние ЧСА в аналогичных концентрациях.
ТБГ оказывал подавляющее влияние на стимулированную ЛЗХЛ лейкоцитов (рис. 1). Эффект ТБГ находился в прямой зависимости от его количества и отмечался при всех использованных концентрациях ОЗ. Чем выше был уровень активации лейкоцитов, тем ярче проявлялось влияние ТБГ. Так, при стиму-
в
10000
1000-
100
ю.
10000.
1000-
100.
ю.
1000
100 -
10
-5—5—5
о
10 50
200
о
10
50 200
О
10
50 200
Рис. 1. Влияние различных концентраций ТБГ (темные точки; М ± т) и ЧСА (светлые точки; М ± т) на люми-нолзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов, стимулированных опсонизированным зимозаном в присутствии аутоплазмы. А, Б и В — концентрации зимозана, соответственно, 0,15 мг/мл, 0,015 мг/мл и 0,0015 мг/мл. По оси абсцисс — концентрации ТБГ и ЧСА (мкг/мл). По оси ординат — относительные световые единицы ^Ш); представлены М ± т.
ляции лейкоцитов ОЗ в концентрации 0,15, 0,015 и 0,0015 мг/мл, ТБГ (200 мкг/мл) угнетал ЛЗХЛ, соответственно, в 23, в 8 и в 5 раз. ЧСА не оказывал влияния на ЛЗХЛ.
Для того чтобы статистически оценить влияние ТБГ, ЧСА и ОЗ был проведен дисперсионный анализ двух параллельных экспериментов (Табл.). Сила влияния (п), выраженная в процентах (общая сумма эффектов всех действующих факторов, учтенных и неучтенных, принималась равной 100%), составила для ТБГ более 20% и была высоко достоверна. В той же системе п ОЗ была в два раза меньше, но статически значима. Достоверным оказался также эффект взаимодействия двух факторов. Это означает, что факторы, обладающие разнонаправленным воздействием на ЛЗХЛ, существенно изменяли результаты действия друг друга. В параллельном эксперименте влияние ОЗ проявлялось значительно сильнее, так как не зависело от присутствия (градаций фактора) ЧСА.
Таким образом, ТБГ оказывал подавляющее действие на ЛЗХЛ лейкоцитов, стимулированных ОЗ в присутствии аутоплазмы. Этот эффект ТБГ находился в прямой зависимости от его концентрации.
Во второй серии экспериментов использовали отмытые лейкоциты крови, что позволило исключить влияние на ЛЗХЛ сывороточных опсонинов. ТБГ использовали в конечной концентрации 50 мкг/мл, ОЗ и НЗ — в концентрации 150 мкг/мл. Эти дозировки были выбраны как эффективные на основании предыдущего эксперимента. Уровень стимулированной люминесценции в отсутствие тестируемых белков достигал 929 RLU и 795 RLU для ОЗ и НЗ, соответственно (рис. 2). Люминесценция отмытых нестимулированных лейкоцитов не превышала 127 RLU.
В опытах с отмытыми клетками вновь воспроизвелся подавляющий эффект ТБГ на ЛЗХЛ лейкоцитов, стимулированных ОЗ (рис. 2, А). Расчеты, проведенные на основе парного
Таблица. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа влияния ТБГ и ЧСА на люминолзависи-мую хемилюминесценцию стимулированных зимозаном лейкоцитов периферичесской крови
Эксперимент Фактор Сила влияния (); % (М ± т) Критерий Фишера (П Р
Оценка влияния ТБГ и зимозана (основной опыт) ТБГ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.