АГРОХИМИЯ, 2015, № 8, с. 32-38
Питание растений
УДК 631.811.2:581.1:577.175:582.683.2
ВЛИЯНИЕ ДЕФИЦИТА ФОСФОРА НА СООТНОШЕНИЕ МАСС
КОРЕНЬ/ПОБЕГ, УДЛИНЕНИЕ И ВЕТВЛЕНИЕ КОРНЕЙ И СОДЕРЖАНИЕ ГОРМОНОВ В РАСТЕНИЯХ АРАБИДОПСИСА*
© 2015 г. А.В. Трекозова1, Г.Р. Ахиярова1, Л.Б. Высоцкая1, С.Ю. Веселов2,
Г.Р. Кудоярова1
1Институт биологии Уфимского научного центра 450054 Уфа, просп. Октября, 69, Россия 2Башкирский государственный университет 450076 Уфа, ул. Заки Валиди, 32, Россия E-mail: vysotskaya@anrb.ru
Поступила в редакцию 29.01.2015 г.
Удаление фосфата из питательного раствора Хогланда-Арнона приводило к перераспределению сырой массы растений арабидопсиса (Col) в пользу корней, а также вызывало стимуляцию их удлинения и ветвления. Снижение содержания цитокининов в побегах и накопление индолилук-сусной кислоты (ИУК) предшествовало увеличению соотношения массы корень/побег и длины главного корня, а снижение содержания абсцизовой кислоты (АБК) - активации роста боковых корней.
Ключевые слова: дефицит фосфора, соотношение массы корень/побег, удлинение и ветвление корней, гормоны, растения арабидопсиса.
ВВЕДЕНИЕ
Растения часто оказываются в условиях дефицита фосфора в окружающей среде из-за низкой растворимости фосфатов в воде. Даже на фоне внесения фосфорных удобрений концентрация фосфатов в почвенном растворе бывает недостаточно высокой [1]. В этих условиях обеспеченность растений фосфором зависит от развития корневой системы, повышающей способность корней поглощать ионы. Показано, что в условиях дефицита фосфора возрастает доля корней в общей массе растений и усиливается их ветвление [2], что способствует их поглотительной активности. Важно понять, как осуществляется регуляция роста и развития корней в условиях дефицита фосфора. Поскольку хорошо известна способность гормонов влиять на соотношение массы побега и корня [3], а также на рост и ветвление корней [4], участию гормонов в ростовом ответе на дефицит фосфора уделялось много внимания [5]. Доминирующая часть исследований проведена с растениями арабидопсиса. Популяр-
* Работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ № 15-04-04750А и Министерства образования и науки РФ, госзадание № 01201456413.
ность этого вида объясняется тем, что его геном уже расшифрован. Это позволило, в частности, получить мутантные растения с разнообразными гормональными нарушениями и с их помощью выявить участие гормонов в регуляции роста и развития корней. С помощью растений арабидопсиса также было выявлено участие гормонов в ростовом ответе на дефицит фосфора [6]. Но данные на этот счет оказались довольно противоречивыми, что, очевидно, можно объяснить особенностями условий проведения опытов [7]. В данных опытах растения арабидопсиса в основном выращивали на агарсодержащих средах с различной концентрацией сахарозы. Вместе с тем было показано, что сама сахароза способна резко изменить реакцию растений на дефицит фосфора [8]. По мнению авторов, более ясное понимание адаптивных реакций растений арабидопсиса на дефицит фосфора могли бы дать эксперименты в гидропонической культуре с растениями, способными к активному фото синтезу и не зависящими от введения углеводов в среду. Этот метод выращивания растений арабидопсиса применялся крайне редко [9], хотя именно такой способ позволяет получить достаточное количество растительного материала для анализа содержания сразу нескольких гормонов.
Цель работы - выявление связи изменения содержания гормонов (цитокининов, абсцизовой кислоты и ауксинов) при дефиците фосфора с особенностями ростовой реакции растений ара-бидопсиса.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Растения арабидопсиса Arabidopsis thaliana экотипа Columbia (Col) после холодовой индукции (в холодильнике при 4°С в течение 3 сут) проращивали в чашках Петри, пересаживали в сосуды с пропитанным 100%-ным раствором Хоглан-да-Арнона (Х-А) песком и выращивали до фазы 2-3-х настоящих листьев. Затем пересаживали на плотики из полистирола с отверстиями, плотики с растениями переносили на питательные растворы (10%- и 50%-ные растворы Х-А; 10%-ный Х-А, не содержащий КН2РО4 и содержащий №Н2РО4 вместо КН2РО4). Растения выращивали в климатической камере при освещенности 120 мкмоль/м2/сек ФАР, температуре день/ночь, равной 23/19°С, относительной влажности воздуха 70%.
Через 5 и 8 сут после перенесения растений на среду с фосфатами и без них взвешивали корни и побеги, измеряли длину главного корня и определяли число боковых корней. Пробы на гормоны собирали через 3 и 5 сут от начала эксперимента. Поскольку гормональная реакция выступает в качестве сигнала, она должна предшествовать обсуждаемому событию, поэтому содержание гормонов определяли на 3-и и 5-е сут, а показатели роста снимали через 5 и 8 сут от начала эксперимента. Известно, что с момента начала первых делений клеток перицикла на стадии формирования примордия и до выхода его на поверхность материнского корня проходит от 36 до 57 ч. Следовательно, через 2 сут после обнаружения гормонального сигнала можно обнаружить не только изменение роста корня в длину, но и изменения ветвления корня как за счет активации роста уже сформированных примордиев, так и за счет вновь сформировавшихся.
Определение содержания фитогормонов после экстракции проводили с помощью иммуно-ферментного анализа (ИФА). Для определения содержания гормонов в тканях растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80%-ным этанолом. Спиртовой экстракт отделяли центрифугированием и упаривали до водного остатка [10]. Цитокинины, содержащиеся в алик-воте водного остатка, концентрировали на картридже С-18 (Bond-Elut, RP-C18). Картридж С-18 уравновешивали дистиллированной водой. Вод-
ный остаток, предварительно осветленный центрифугированием, наносили на колонку, которую затем промывали 10 мл дистиллированной воды. Цитокинины элюировали 80%-ным спиртом, который упаривали досуха и, растворив в 0.02 мл 80%-ного спирта, наносили на силуфоловую пластину для тонкослойной хроматографии (Merck 50 х 200 х 0.25 мм силикагеля 60 F-254). Разделение цитокининов проводили в системе растворителей бутанол : аммиак : вода (6 : 1 : 2). После детекции в УФ-свете положения метчиков зеатина, дигидрозеатина, изопентениладенина и их рибо-зидов содержимое зон элюировали 0.1 М фосфатным буфером (ФБ) рН 7.4. После удаления сили-кагеля путем центрифугирования в надосадочной жидкости определяли содержание цитокининов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя антитела к зеатинрибозиду, которые имеют высокую специфичность к производным зеатина и высокую иммунореактивность к зеатину, рибозиду и нуклеотиду зеатина [11]. Достоверность результатов, полученных с помощью метода иммуноанализа, подтверждена путем разведения растворов, хроматографическим распределением иммунореактивности и сопоставлением с данными хромато-масс-спектрометрии [11, 12]. В таблицах представлены данные суммы цитокининов, включающие зеатин, зеатинрибозид, зеатиннуклеотид. Для определения содержания ИУК и АБК аликвоту водного остатка разбавляли дистиллированной водой, подкисляли HCl до pH 2.5 и дважды экстрагировали диэтиловым эфиром (соотношение органической фазы и неорганической 1 : 3). Далее гормоны переводили в 1%-ный раствор гидрокарбоната натрия (pH 7-8, соотношение органической и неорганической фазы 2 : 1). Метилирование гормонов диазометаном и иммуноферментный анализ проводили после ре-экстракции гормонов диэтиловым эфиром, предварительно подкислив водный раствор до pH 2.5. Для ИФА использовали иммуно специфическую сыворотку, содержащую антитела к ИУК и АБК соответственно.
Эксперименты повторяли не менее 3-х раз. При определении гормонов биологической повтор-ностью служили 15-20 растений (один образец). Определение содержания гормонов в каждом образце проводили в трех аналитических повтор-ностях. Для оценки ростовых параметров использовали индивидуальные растения. Достоверность различий оценивали по i-критерию Стьюдента с помощью программ MS Excel. Данные на рисунках и в таблице представлены средними арифметическими и их стандартными ошибками.
Масса побега и корня, соотношение масс корень/побег, длина корня, число боковых корней (БК) и их плотность у растений арабидопсиса через 5 и 8 сут после их переноса на 10%-ный раствор Хогланда-Арнона (Х-А), содержащий №Н2РО4 (контроль) и не содержащий фосфат (опыт)
Среда выращивания Масса побега, мг Масса корня, мг Корень/побег, мг/мг Длина корня, мм Число БК Плотность БК, число БК/мм
5 сут
10% Х-А 6.2 ± 0.7 0.87 ± 0.13 0.14 54 ± 3 10.0 ± 0.4 0.19
10% Х-А без 5.6 ± 0.6 1.60* ± 0.12 0.29 73* ± 4 12.6 ± 0.2 0.17
КН2РО4
8 сут
10% Х-А 8.1 ± 0.9 1.9 ± 0.3 0.23 56 ± 4 10.8 ± 1.0 0.19
10% Х-А без 7.6 ± 0.7 2.5 ± 0.3 0.33 76* ± 3 17.9* ± 0.5 0.24
КН2РО4
Статистически достоверно отличающиеся от контроля результаты опыта,р < 0.01, п = 30.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ литературы показал, что подавляющее большинство работ с арабидопсисом выполнено с использованием агаровых сред для выращивания растений, что затрудняет как интерпретацию результатов, так и сбор достаточного для анализа гормонов растительного материала. Использование жидких питательных растворов решало эту проблему и, кроме того, состав их можно было легко варьировать для создания дефицита фосфора. Опираясь на немногие работы, в которых уже применяли такой подход [9], авторы подобрали для выращивания арабидопсиса оптимальную концентрацию раствора Хогланда-Арнона, при которой растения накапливали максимальную сырую массу в течение эксперимента. Таким раствором оказался 10%-ный Х-А (0.5 тМ К1М03, 0.5 тМ Са(Ш3)2, 0.1 тМ КН2Р04, 0.1 тМ MgSO4).
Далее непосредственно в экспериментах, моделируя дефицит фосфора, авторы удаляли из среды фосфатсодержащую соль КН2РО4, в результате чего концентрация ионов калия несколько снижалась. Поэтому необходимо было убедиться, что ростовая реакция арабидопсиса при этом воздействии обусловлена отсутствием в питательной среде фосфора, а не части ионов калия. С этой целью фиксировали рост растений после замены КН2РО4 на №Н2РО4 в питательном раствор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.