научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ДЕКСАМЕТАЗОНА И ГИПОКСИИ НА СОДЕРЖАНИЕ АКТИВНОЙ КАСПАЗЫ-3 В МОЗЖЕЧКЕ И ПОВЕДЕНИЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫСЯТ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ДЕКСАМЕТАЗОНА И ГИПОКСИИ НА СОДЕРЖАНИЕ АКТИВНОЙ КАСПАЗЫ-3 В МОЗЖЕЧКЕ И ПОВЕДЕНИЕ НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫСЯТ»

ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 6, с. 616-620

ФИЗИОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

УДК 577.171.5:577.171.7:577.25:612.65:612.827:612.881

ВЛИЯНИЕ ДЕКСАМЕТАЗОНА И ГИПОКСИИ НА СОДЕРЖАНИЕ АКТИВНОЙ КАСПАЗЫ-3 в мозжечке и поведение НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫСЯТ

© 2014 г. В. В. Булыгина*, П. Н. Меньшанов*, Д. А. Ланшаков*, **, Н. Н. Дыгало*, **

*Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10 ** Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2 E-mail: veta03@mail.ru Поступила в редакцию 21.11.2013 г.

Установлено, что синтетический глюкокортикоид дексаметазон снижал двигательную активность неонатальных крысят через 120 ч после введения. Отмечено, что изменению поведения сопутствовало увеличение в мозжечке содержания активной каспазы-3. Экспрессия этой протеазы апоптоза не отличалась от контрольного значения, если при действии дексаметазона животные испытывали гипоксию, но сниженная гормоном двигательная активность при этом не нормализовалась. Показано, что проапоптозное действие дексаметазона блокируется при гипоксии, чего, однако, недостаточно для предотвращения влияния гормона на поведение.

DOI: 10.7868/S0002332914060022

В раннем онтогенезе головной мозг млекопитающих высокочувствителен к повышенным количествам гормонов стресса глюкокортикоидов и гипоксии (Kreider et al., 2006; Kalinina et al., 2012; Kalinina, Dygalo, 2013; Menshanov et al., 2013), которые при гормональной терапии респираторного дистресс-синдрома действуют одновременно и нередко приводят к серьезным и длительным нарушениям физиологических функций организма и поведения (Doyle et al., 2010). Эти последствия могут быть вызваны активацией протекающей в мозге в этот период массовой программируемой гибели клеток (Menshanov et al., 2006; Men'shanov et al., 2011; Muzyka et al., 2012) и обусловленным ею нарушением формирования морфологии и ре-гуляторных механизмов центральной нервной системы (Kreider et al., 2006; Duksal et al., 2009). Повышение экспрессии основной исполнительной протеазы апоптоза каспазы-3 во фронтальной коре крысят после введения им дексаметазона сопровождалось более ранним открытием глаз и задержкой формирования стартл-рефлекса ("реакции вздрагивания") (Menshanov et al., 2012).

Одним из наиболее просто выявляемых маркеров нарушения формирования мозга может быть изменение в неонатальном онтогенезе двигательной активности (Menshanov, Dygalo, 2007; Men'shanov, 2012). Центральным регулятором этой активности является мозжечок. Недавно обнаружено, что дексаметазон повышает содержание активной каспазы-3 в этой структуре головного мозга крысят (Noguchi et al., 2011). Однако такой эффект наблюдали при применении гормона в дозе,

более чем на порядок превышающей терапевтическую. Оказывает ли подобное действие физиологическая доза гормона и, главное, проявляются ли последствия гормонального воздействия изменениями двигательной активности неонатальных крысят, остается неясным.

Цель работы — исследование влияния декса-метазона и совместного действия гормона и гипоксии на содержание активной каспазы-3 в мозжечке и двигательную активность неонатальных крысят.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на крысах линии Ви-стар. Крыс содержали в условиях свободного доступа к воде и корму в виварии ИЦиГ СО РАН и использовали в опытах согласно Правилам гуманного обращения с экспериментальными животными, утвержденным комиссией по биоэтике ИЦиГ СО РАН в соответствии с Директивой Европейского Парламента и Совета ЕС 2010/63/Еи от 22 сентября 2010 г. и Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12 августа 1977 г.).

Трехсуточным крысятам вводили дексамета-зон (КЯКА, Словения, 0.2 мг/кг в объеме 20 мкл) либо физиологический раствор (физ. р-р, 0.9% №С1). В эксперименте, в котором определяли содержание активной каспазы-3 в слоях мозжечка, использовали дополнительную контрольную

ВЛИЯНИЕ ДЕКСАМЕТАЗОНА И ГИПОКСИИ

617

группу — интактных животных. Через 4 ч после введения препаратов у части животных вызывали гипоксию, помещая их на 15 мин в атмосферу 100%-ного азота при 36 ± 1°С (Takada et al, 2011). Двигательную активность крысят оценивали через 24 и 120 ч после воздействий по числу пересеченных их передней правой лапой линий на площадке 20 х 30 см, расчерченной на квадраты 2 х 2 см, в течение 1 мин. Активную каспазу-3 в мозжечке выявляли иммуногистохимически (Lanshakov et al., 2009; Shishkina et al., 2010) через 120 ч после воздействий. Выбор возраста животных для анализа воздействия дексаметазона обусловлен соответствием степени зрелости головного мозга у трехсуточных крысят степени развития центральной нервной системы новорожденных детей (Dobbing, Sands, 1979). После глубокого холодо-вого наркоза крысят транскардиально перфузиро-вали 0.02 М фосфатным буфером (PBS) и 4%-ным раствором параформальдегида в 0.02 М PBS, использовали специфичные к активной каспазе-3 первичные кроличьи антитела (#9661 Cell Signalling, Англия) в разведении 1 : 100. После инкубации с биотинилированными вторичными антителами козы против иммуноглобулина (IgG) кролика (sc2040, Santa Cruz, США) в разведении 1 : 100 далее проводили инкубацию со стрептави-дином, конъюгированным с пероксидазой хрена (sc7401, Santa Cruz), в разведении 1 : 500. Перок-сидазную активность выявляли 3,3'-диаминобен-зидином. Содержание активной каспазы-3 определяли на сагиттальных срезах мозга толщиной 18 мкм по значению оптической плотности клеток на цифровых фотографиях (увеличение х200) в 2—3 полях зрения от четырех животных каждой группы. Результаты оценивали статистически двухфакторным дисперсионным анализом (факторы — гормон и гипоксия) с последующим выявлением межгрупповых различий по критерию LSD Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Введение дексаметазона трехсуточным животным существенно снизило через 24 ч прирост массы тела по сравнению с контролем (влияние дексаметазона - Д2.100) = 96.8, р < 0.0001, 1.11 ± ± 0.08 г (физ. р-р), 0.98 ± 0.08 г (физ. р-р и гипоксия), 0.07 ± 0.06 г (дексаметазон), -0.12 ± 0.09 г (дексаметазон и гипоксия)). Этот эффект закономерен, поскольку повышенный уровень глюко-кортикоидов активирует в организме катаболиче-ские процессы. Гипоксия также достоверно снижала прирост массы тела через 24 ч после воздействия (влияние гипоксии — Д1.100) = 7.45, р < 0.0075), однако анализ межгрупповых различий подтвердил это лишь на уровне тенденции и только у контрольных животных. Масса тела крысят (18.5 ± 0.53 г (физ. р-р), 17.59 ± 0.52 г (физ. р-р

<ч о н

св ft

rn w

й 3 Я

я

(U

о о о

£ 20

60 -

40 -

Рис. 1. Локомоторная активность трехсуточных крысят через 120 ч после воздействия дексаметазоном и/или гипоксией. 1 — введение физ. р-ра, 2 — дексаметазона. * — р < 0.05 по сравнению животными, получавшими физ. р-р, # — р < 0.05 по сравнению животными, получавшими физ. р-р и перенесшими гипоксию.

и гипоксия), 15.43 ± 0.31 г (дексаметазон), 14.59 ± ± 0.58 г (дексаметазон и гипоксия)) оставалась сниженной и через 120 ч после гормонального воздействия (влияние дексаметазона — Д1.43) = = 37.77, р < 0.0001). Влияние гипоксии на массу тела в это время было также на уровне тенденции (гипоксия — Д1.43) = 3.14,р < 0.084).

Дексаметазон и гипоксия как при раздельном, так и при совместном применении не изменяли двигательную активность крысят через 24 ч после воздействий (дексаметазон — Д1.43) = 0.03, р = = 0.87; гипоксия — Д1.43) = 0.01, р = 0.98). Однако в более поздний срок, через 120 ч, у крысят, получавших дексаметазон, наблюдалось значительное снижение двигательной активности (Д1.43) = = 10.66, р < 0.002) (рис. 1). Следует отметить, что снижение локомоторной активности после нео-натального воздействия дексаметазоном отмечалось даже у взрослых животных (№а1 а1., 2004). Поведение крысят, испытавших только гипоксию, и через 120 ч, как и через 24 ч, не отличалось от контроля (Д1.43) = 0.87, р = 0.35). Перенесенная гипоксия не влияла также и на вызванное гормоном снижение двигательной активности.

Дексаметазон через 120 ч после введения, в период проявления его поведенческого эффекта, существенно повышал, как видно на микрофотографиях (рис. 2), содержание активной каспазы-3 в слое клеток Пуркинье мозжечка. Статистический анализ данных денситометрии микрофотографий (рис. 3) подтвердил, что содержание кас-пазы-3 в этом слое мозжечка восьмисуточных крысят, инъецированных дексаметазоном в трехсуточном возрасте, достоверно повышено по сравнению с таковым у животных контрольных групп (Д2.17) = 5.30, р < 0.02). При этом гормон

0

1

2

ш-'

-•''= ...

Г . V . .

■ 1

- ' • Ж'к-.

1

Ш/Шк^' ■

. . V

■ V.

ш

&;: -

' Ш:

. -

уМ

• ■ (а) . .

.-А^'- ■- -V ч

. - ■; > А •

&•«« • _|

1 ' 2 "'"■>■' ^ \

- - •,

Ж*

- " I *; ;

ч^Г

- д > .

(б) .

кЩ

• ..' ."Г

1 л * •:. " • ■"

'' . V. , - 2 \ '

■У^рг

Г ■ ■■ •■Л-.; V- ? - ■ ; ■ -г ■ '-г ■.с..•., ~ Л:- г

■■а шш • Ч О Ч. V

1 ■ '"^т

4 : ■ 'ф ' -• да1

¡Щ<0*

ш ■

\

\ ■

ж* -уШ,

■ -г- -; »,

■ ш

в «й - -I- -- •

(в)

"'Л:

^.■'■'ЙЙг

-

I-

; (г)

аг

Рис. 2. Иммуногистохимически в^1являемая активная каспаза-3 (темные зерна) (непрямым пероксидазным методом) в мозжечке восьмисуточн^гх крысят через 120 ч после воздействия дексаметазоном и/или гипоксией. а — физ. р-р, б — дексаметазон, в — физ. р-р и гипоксия, г — дексаметазон и гипоксия (увеличение х200). 1 — внешний гранулярный слой, 2 — слой клеток Пуркинье. Масштаб: 1 мкм.

0.03

д

о ч

о ^

£ 0.02

о

о £

о ч с

«

а

м

о

о ¡^

15

с

о

0.01

1 Нормоксия (а)

1

1

I

I

Гк

'А Гипоксия (б)

I

1

12 3 12 3

Рис. 3. Результаты денситометрии активной каспазы-3 в слоях мозжечка восьмисуточных крысят через 120 ч после воздействия дексаметазоном и/или гипоксией. а — внешний гранулярный слой, б — слой клеток Пуркинье. 1 — интакт-ные, 2 — введение физ. р-ра, 3 — дексаметазона. * — р < 0.001 по сравнению со всеми группами животных, представленных в этой части рисунка.

0

ВЛИЯНИЕ ДЕКСАМЕТАЗОНА И ГИПОКСИИ

619

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком