= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ДИБРОМТИМОХИНОНА НА ПАРАМЕТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА а В КЛЕТКАХ Chlamydomonas reinhardtii, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ НА ПОЛНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ И В УСЛОВИЯХ СЕРНОГО ГОЛОДАНИЯ
© 2008 г. А.А. Волгушева, Г.П. Кукарских, Т.К. Антал, О.Г. Лаврухина,
Т.Е. Кренделева, А.Б. Рубин
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,
119991, Москва, Воробьевы горы
Поступила в p едакцию 20.03.08 г.
Методами РАМ- и РЕА-флуор ометрии изучено влияние дибромтимохинона на флуоресценцию хлорофилла в клетках Chlamydomonas гвткагАи, выращенных на полной питательной среде и в условиях голодания по сер е. Показано, что дибромтимохинон по-разному действует на флуоресценцию контрольных и голодающих клеток. Выход флуоресценции в контрольных суспензиях под действием ингибитор а значительно увеличивается. П редполагается, что это связано с подавлением пр отеинкиназной активности, вследствие чего часть светособирающего комплекса II, которая могла бы диффундировать из стыкованной зоны мембраны в ламел-лярную к фотосистеме I, остается вблизи фотосистемы II. У голодающих по сере клеток, фотосинтетический аппар ат которых находится в состоянии 2, в пр исутствии дибромтимохинона ур овень флуор есценции понижается. П роведенный стандартный ЛР-анализ индукционных кривых (О-М-Р-пер еходы) позволяет пр едположить, что в контр ольных клетках дибр омтимо-хинона ингибирует не только киназу светособирающего комплекса II, но и электронный транспорт, в случае голодающих клеток он действует как акцептор электронов.
Ключевые слова: серное голодание, дибромтимохинон, флуоресценция хлорофилла, Chlamydomonas гвМаЫН1.
Культивирование водорослей Chlamydomo-nas reinhardtii на среде, не содержащей сульфатов, в замкнутых биореакто рах на свету сопровождается выделением водор ода. Это может быть использовано в качестве биотехнологического пр иема для разнесения во времени процессов выделения кислорода и водорода. Основным донором электр онов для гидрогеназной реакции у этих микроводоро слей является вода, однако выделяющийся в первичных процессах фотосинтеза кислород ингибир ует гидр огеназу. При недостатке серы в ср еде постепенно понижается активность фотосистемы (Ф С) II, скорость выделения кислорода становится ниже скорости его потребления в процессе дыхания, культура переходит в состояние анаэробиоза, а когда активируется гидрогеназа, начинается выделение водорода [1-4]. При серном голодании в течение первых трех суток содержание
Сокращения: Ф C - фотосистема, CCK II - светособираю-щий комплекс, ЭТЦ - электрон-транспортная цепь, ДБТХ -дибромтимохинон (2,5-дибром-3-метил-6-изопропил-р-бен-зохинон).
хлорофилла и количество клеток в суспензии С. reinhardtii практически не изменяются, хотя обнаруживаются существенные нарушения в первичных процессах фотосинтеза [5]. Наблюдаются изменения в р аспределении поглощенной световой энергии между разными путями ее диссипации. Фотохимическое тушение уменьшается из-за нарушения электронного транспорта, поскольку происходят повреждения части реакционных центров как с акцепторной (появление Qв-невоccтанавливающиx центров), так и с донорной стороны, на что указывает появление К-пика в кинетике нарастания флуоресценции и замедление ее темновой релаксации [4,6]. Несмотря на существенное увеличение содержания Q в-невосстанавливающих центров, пул хинонов перево сстанавливается вследствие поступления электронов от эндогенных восстановителей, накапливающихся при серном голодании, через цепь хлор одыхания. Именно этот путь рассматривается как добавочный источник электронов для не подавляемой диуроном части выделяемого на свету водорода [7]. Нарушение электронного транспорта между фотосистемами сопровождается снижением нефотохимического
787
5*
тушения, главным образом, за счет АрИ-зави-симой компоненты qE и нарушения работы виолаксантинового цикла [8]. Излучательная диссипация, напр отив, повышается, о чем свидетельствует резкое увеличение (в два-три раза) выхода флуор есценции (0) в расчете на единицу хлорофилла [5,8]. Обнаруженное нами увеличение при серном голодании может быть связано с нарушением диссипативного цикла с участием цитохрома 6559 [9]. Как было показано ранее, при сер ном голодании нар у-шаются и процессы перехода светособир ающего комплекса II (ССК II) между фотосистемами, связанные с активностью ССК П-киназы и фос-фатазы, фотосинтетический аппарат голодающих клеток находится преимущественно в состоянии 2 [5]. Хотя молекулярный механизм активации ССК П-киназы до конца не выяснен, не вызывает сомнения, что важную роль играет изменение конформации одной из субъединиц цитохр омного комплекса - железо-серного белка Риске, обладающего способностью изменять положение в мембране при восстановлении [10,11]. Активация этой киназы носит динамический характер и может вызываться за счет взаимодействия белка Риске с трансмембранным сегментом фер мента. В настоящей работе мы использовали метод флуор ометр ии хлор о -филла, позволяющий судить об изменении как процессов фотосинтетического электронного транспорта, так и переходов между состояниями 1 и 2, и о влиянии дибромтимохинона (ДБТХ) на оба эти пр оцесса. Этот ингибитор был впер вые введен Т р еб стом [12,13] в качестве специфического ингибитора электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) на уровне цито-хромного комплекса. Он конкур ентно связывается в Qо сайте, причем существенно, что комплексы типа Ь6/с к этому ингибитор у не чувствительны. Пр очно связанный с цито-хромным ¿¿//-комплексом ДБТХ пр епятствует окислению молекул PQH2 цитохромным комплексом [11,14] и подавляет как электр онный транспорт, так и фотоиндуцированное выделение водорода [7]. В процессе связывания ДБТХ в Qо сайте фиксируется конформация субъединицы Риске, препятствуя динамическому активированию ССК П-киназы [15]. Показано также, что в некоторых условиях он может акцептировать электроны от [16].
Поскольку голодающие по сере клетки С. ге-ткаМШ отличаются от контр ольных по со -стоянию фотосинтетического аппарата как в отношении энергетического сопряжения антенн с реакционными центрами, так и функционирования самих ЭТЦ, представляло интерес сравнить действие ДБТХ на параметры флуоресценции контрольных и голодающих по сере культур.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование водоро слей. Chlamydomo-nas reinhardtii выращивали фотогетеротрофно на трис-ацетат-фосфатной среде, рН 7,0 в конических колбах объемом 300 мл на шейкере пр и 25°C и освещенности 100 мкЕ м-2-с-1 до концентрации 4 - 6 млн кл. мл-1 (поздняя логарифмическая фаза роста). Затем клетки тр и-жды о саждали и ресуспендир овали в среде без серы либо в полной среде (контроль), после чего инкубировали при аналогичных условиях в течение 72 ч. При культивировании клеток мутанта C. reinhardtii D1-R323D освещенность была понижена до 50 мкЕ м-2-с-1.
РАМ-флуорометрия. Флуоресценцию хлор офилла регистр ир овали с помощью флуор о -метр а PAM-2000 (Pulse АшрШ;и<1е Modulation) (Walz, Effeln^, Гер мания), возбуждая модулированными импульсами света интенсивностью 0,1 мкЕ м-2-с-1, длительностью 3 мкс и частотой 600 Гц в темноте или 20 кГц на свету (светодиоды Н-3000 Stanley, X = 655 нм). Пар аметр ы флуор есценции хлор офилла регистрировали с использованием компьютерной пр огр аммы Da-2000 (Heinz, Walz). В ходе экспер иментов регистр ир овали следующие пар аметр ы флуор есценции: Fo - интенсивность флуоресценции хлорофилла в адаптированных к темноте обр азцах; Fm - интенсивность флуо-р есценции хлор офилла во вр емя действия 0,8 с насыщающей вспышки света, восстанавливающей первичные хинонные акцепторы Qа до Qa (20 Вт галогеновая лампа, X < 710
нм, 1100 мкЕ м-2-с-1). Кинетики световой индукции и темновой релаксации переменной флуор есценции р егистр ир овали с помощью стандартной программы Run 6. Интенсивность измер яющего света 0,3 мкЕ м-2-с-1, интенсивность актиничного 450 мкЕ м-2-с-1 (с частотой 20 кГц), длительность освещения 2 с.
РЕА-флуорометрия. Кинетики световой индукции флуоресценции с высоким временным разрешением регистр ир овали с помощью РЕА-флуор ометра (Plant Efficiency Analyzer) (Hansa-te^, King's Lynn, Norfolk, UK). Флуоресценцию хлорофилла инициировали красным светом (X = 650 нм) интенсивностью 3000 мкЕ м-2-с-1. Флуоресценцию регистрировали в области > 680 нм с временным разрешением 10 мкс в течение первых 2 мс, 1 мс в интервале времени 2 мс -1 с и 100 мс в интервале времени > 1 с. За величину Fo принимали величину флуоресцентного сигнала, регистрируемую через 50 мкс после включения источника постоянного света. Использование логарифмической шкалы времени позволяло разделить фазы роста флуоресценции.
Концентрация клеток, используемая в экс-пер иментах, со ставляла (5 - 6) -106 кл/мл. Перед измерением образцы выдерживали 3 мин в темноте в присутствии спиртового раствора ДБТХ или такого же количества спирта (не более 1%) в контрольных образцах.
Количественный анализ характер истик первичных процессов фотосинтеза на основе параметров кинетической кр ивой проводили с помощью так называемого «ЛР-теста», основанного на теории энергетических потоков [17]. Согласно этой теории энергия возбуждения в антенне может использоваться в пр оцессах фотосинтеза или диссипировать в виде тепла и флуор есценции. Измер яемые параметр ы флуоресценции, а также формулы, используемые в ЛР-тесте, и краткие объяснения к ним представлены в табл. 1 [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фотосинтетический аппарат высших растений и зеленых водорослей может находиться в двух состояниях: высокофлуоресцир ующем состоянии 1, когда большая часть ССК II находится около Ф С II, и низкофлуоресцир ующем состоянии 2, когда часть ССК II, фосфорили-рованных при участии ССК П-киназы, переходит к Ф С I [19]. В эксперименте переход в состояние 2 можно индуцировать без света, изменяя редокс-состояние пула хинонов [15]. Так, пр и продувании аргоном суспензии микроводорослей С. reinhardtii восстанавливаются переносчики электронов между фотосистемами, это индуцирует переход в низкофлуоресцирую-щее состояние 2. Последующее освещение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.