БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ ^
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ЖЕЛЕЗА С ГЛУТАТИОНОМ КАК ДОНОР А ОКСИДА АЗОТА НА КРОВООБРАЩЕНИЕ У ЗДОРОВЫХ ЖИВОТНЫХ
© 2008 г. М.И. Ремизова, Н.И. Кочетыгов, К.А. Гербут, А.Ф. Ванин*
ФГУ Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Росздрава,
Санкт -Пет ербург;
*Институт xимической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991, Москва, ул. Косыгина, 4
E-mail: vanin@polymer. скрк. ras. ru Поступила в p едакцию 05.12.07 г. После доработки 18.06.08 г.
Показано, что гипотензивное действие донора оксида азота - динитрозильного комплекса железа с глутатионом - на организм здоровых крыс, обусловленное уменьшением общего перифер ического сопротивления, не пр иводит к ухудшению микроциркуляции и сопр овождается усилением сократительной активности миокарда. В условиях гипотонии, вызванной динитро -зильным комплексом железа, не изменяется по сравнению с контролем ни напряжение кислорода и углекислого газа в кр ови, ни ее кислотно-основное со стояние. Таким образом, возможное ингибитор ное действие этого комплекса на некоторые ферменты и белки в о р ганизме животных не сказывается на функционир овании сердца, со судов и кр ови. Динитр озильный комплекс железа с глутатионом вызывает только снижение артериального давления. Предполагается, что на основе таких комплексов, а также комплексов с другими тиоловыми лигандами может быть создан новый тип пр епаратов для лечения сердечно сосудистых заболеваний.
Ключевые слова: оксид азота, динитрозильные комплексы железа, гипотензия.
Нитрозовазодилататоры, активным метаболитом котор ых является оксид азота (N0), широко применяются для лечения заболеваний, сопровождающихся недостаточной генерацией эндогенного N0 [1,2]. Известно, что гипотензивное действие наиболее распространенных ва-зодилататор ов - нитроглицерина и нитропр ус-сида - коррелирует с выделением из них N0 [3-5]. Однако нитропруссид высвобождает также и токсичный цианид, а к нитроглицерину у многих пациентов быстро развивается толерантность. Поэтому в последние годы большое внимание уделяется поиску новых доноров N0, которые могли бы со ставить основу будущих лекарственных препаратов. Одним из перспективных доноров N0 являются динитр озильные комплексы железа (ДНКЖ) с тиолсодержащими лигандами. В связи с этим цель данной работы состояла в изучении на здоровых крысах влияния ДНКЖ с глутатионом на кровообращение
Сокращения: N0 - оксид азота, АД - артериальное давление; ВЕ - дифицит буферных оснований; ДНКЖ -динитрозильный комплекс железа; МОК - минутный объем кровообращения; ОПС - общее периферическое сопротивление; РИЛЖ - рабочий индекс левого желудочка; УО - ударный объем сердца; ЧСС - частота сердечных сокращений.
(системную гемодинамику и микроциркуляцию), кислотно-основное состояние и содержание газов в крови.
Ранее в работах [5-10] было показано, что однократное введение ДНКЖ с тиолсодержа-щими лигандами наркотизированным или бодрствующим животным вызывает у них длительную гипотензию - до 1 ч. В этом отношении данные комплексы выгодно отличаются от нит-ропруссида - мононитрозильного комплекса железа с цианидом, гипотензивное действие которого при однокр атном введении длится всего несколько минут [4]. Тем не менее, как и нитропруссид, ДНКЖ могут оказывать токсическое действие на организм. Это пр едположение следует из ряда исследований, в которых было обнаружено ингибиторное действие этих комплексов на некоторые ферменты и белки -глутатионтрансферазу [11], К^а-АТФазу [12], глутатионредуктазу [13], железосерные белки [14]. В связи с этим мы изучили влияние ДНКЖ на ряд о сновных физиологических показателей сердца, сосудов и крови животных с тем, чтобы проверить, не сказывается ли ингибиторное действие ДНКЖ, по крайней мер е, на перечисленные ферменты и белки, на состоянии этих органов и тканей.
867
10*
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали восстановленный глутатион (Reanal, США) и сульфат закисного железа (Fluka, Швйцария). Газообразный NO получали в реакции сульфата закисного железа с нитритом натрия в 0,1N HCl с последующей его очисткой методом низкотемпературной сублимации в вакуумированной системе [15].
Синтез ДНКЖ с глутатионом. ДНКЖ с глутатионом синтезировали двумя способами. В первом была использована способность S-нитрозотиолов, например S-нитрозоглутатиона (GS-NO), образовывать ДНКЖ в присутствии двухвалентного железа и тиолов [16]. Во втором способе использовали способность газообразного оксида азота образовывать ДНКЖ в его реакции с двухвалентным железом и тиолами [17]. Синтез GS-NO проводили следующим способом. В 1 мл дистиллированной воды растворяли 180 мг глутатиона, который как кислотный агент снижал рН раствора до 2,5, что и обеспечивало образование GS-NO после добавления в него нитрита натрия [8]. Последний вводили в раствор в количестве 3,5 мг в 0,1 мл дистиллированной воды. Сразу после его введения раствор приобретал розовую окраску, обусловленную обр азованием GS-NO. Затем в раствор добавляли 4 мл 15 мМ HEPES буфера (рН 7,4), доводили рН раствора до 7,4 введением насыщенного раствора NaOH, после чего к 5 мл полученного ра створ а добавляли 0,1 мл раствор а цитратного комплекса сульфата сернокислого железа. Раствор приготовляли, добавляя 83 мг сульфата сер нокислого железа + 400 мг цитрата натрия в 1 мл дистиллированной воды. После добавления цитр атного комплекса железа раствор GS-NO приобретал оранжево-зеленую окраску, обусловленную образованием ДНКЖ с глутатионом. Концентрация последнего в растворе составляла 5 мМ. Синтез ДНКЖ с использованием газообразного оксида азота проводили в аппарате Тунберга по методике, описанной в работе [15].
ДНКЖ с глутатионом более стабилен в раствор е, чем ДНКЖ с другим природным тио-лом, цистеином [19]. При хранении на воздухе в течение 1 ч его содержание в раствор е снижается не более чем на 10%. При суточном хр анении оно снижает в три раза. Для стабилизации раствор высушивали в пр исутствии водорастворимого полимера в соответствии с методом, изложенным в патенте РФ № 2291880. Полученный препарат сохранялся без изменения его физико-химических и биологических свойств при хранении в сухом воздухе по крайней мере в течение года.
Эксперименты на животных. В экспериментах использовали белых крыс - самок линии
Вистар массой 130 - 230 г. Наркотизированных тиопенталом натрия (35 - 40 мг/кг) животных фиксировали на станке, катетеризировали сонную ар тер ию для измерения ар тер иального давления (АД) и забора проб крови. П р оизводили лапаратомию, выводили в разрез участок тонкой кишки для изучения в ней микроциркуляции. Животным подкожно вводили электроды с целью определения ударного объема сердца (УО) методом тетраполярной реографии [20]. Частоту сердечных сокращений (Ч CC) определяли по электрокардиограмме. Определение ударного объема сердца позволило рассчитать показатели минутного объема кровообращения (МОК) и общего перифер ического сопр отивле-ния (ОПC). Расчет минутного объема кровообращения (мл/мин-100 г массы) пр оизводили по формуле: УОЧ CC; общего периферического сопротивления (дин-с-см-5-10-4/кг-массы) по формуле: АД/МОК-1332-60-10-4/кг; рабочий индекс левого желудочка (РИЛЖ, кГм/кг-мин) по формуле: АД-МОК-0,0135. Микроциркуляцию исследовали методом прижизненной контактной микроскопии в отр аженном свете в сер о зной оболочке тонкой кишки. Использовали метод количественной оценки по шкале, разработанной в лаборатории [21]. В артериальной крови определяли содержание газов, кислотно-о снов-ное со стояние на газоанализаторе АВЬ-500 (Radiometer). Уровень гемоглобина (Н b) оценивали методом [22].
Проводили две серии экспериментов. Во втор ой серии животным в кровоток (в/в) вводили ДНКЖ из расчета 3,2 мкМ/кг (что соответствует введению железа в составе комплекса в дозе 180 мкг/кг) в 0,17 - 0,20 мл изотонического раствора натр ия хлор ида. В первой серии (контроль) вводили изотонический раствор натр ия хлорида в том же объеме. ^с^мную гемодинамику и микроциркуляцию исследовали в исходном состоянии через 1, 20, 40 и 60 мин после введения изотонического раствора натрия хлорида (первая серия) и ДНКЖ (вторая серия). Забор проб крови производили в исходном состоянии, через 20 и 60 мин после инъекции. Полученный цифровой материал обработан с использованием методов непараметрической статистики в компьютерной программе (Ехсе1 5.0).
РЕЗУЛЬТАТЫ
У здоровых фиксированных на станке животных (первая серия) АД в течение всего периода наблюдения не изменялось (табл. 1). Значения удар ного объема сердца и минутного объема кровообращения также оставались пр актически одинаковыми с значениями исходных величин. К 60-й мин фиксации несколько
Таблица 1. Системная гемодинамика в контр оле при введении изотонического раствор а натрия хлорида и ДНКЖ
Показатели Серии** И сходные значения Вр емя от начала введения изотонического р аствор а натрия хлорида или ДНКЖ, мин
1 20 40 60
АД, 1 138 ± 4 136 ± 4 140 ± 3 137 ± 4 136 ± 2
мм рт. ст. 2 142 ± 2 86 ± 4+* 107 ± 5+* 121 ± 2+* 128 ± 3+*
МОК, 1 14,6 ± 0,2 14,9 ± 0,4 14,6 ± 0,2 13,2 ± 0,6 14,0 ± 0,5
мл/мин-100 г 2 14,8 ± 0,2 14,1 ± 0,8 16,4 ± 1,3 18,8 ± 1,5+* 18,2 ± 1,1
УО, 1 0,35 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,34 ± 0,02 0,33 ± 0,03 0,33 ± 0,02
мл/кг 2 0,34 ± 0,01 0,33 ± 0,02 0,41 ± 0.03+* 0,43 ± 0,03+* 0,44 ± 0,04+*
ОПС, 1 7,6 ± 0,2 7,3 ± 0,1 7,7 ± 0,2 8,5 ± 0,6 7,9 ± 0,5
дин-с-см-5-10-4
/кг 2 7,6 ± 0,1 5,0 ± 0.5+* 5,5 ± 0.4+* 5,4 ± 0.4+* 6,0 ± 0,4+*
РИЛЖ, 1 270 ± 10 278 ± 13 274 ± 7 242 ± 13 257 ± 9
кГм/кг-мин 2 284 ± 6 163 ± 13+* 240 ± 25 309 ± 30 314 ± 33
Ч СС, 1 420 ± 17 424 ± 13 433 ± 17 411 ± 17 424 ± 17
уд/мин 2 436 ± 6 423 ± 11 406 ± 14 429 ± 12 417 ± 13
Примечания. **-введение ДНКЖ.
Серия 1 (п = 7) - введение изотонического раствора натрия хлорида; серия 2 (п = + * - Достоверность различий по сравнению с исходной величиной и между сериями
= 11), М ± т -соответственно.
уменьшился рабочий индекс левого желудочка. Значения Ч СС, ОП С не отличались от исходных значений (табл. 1). П ри исследовании со стояния микроциркуляц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.