БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 6, с. 1173-1179
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 533.92:537.525
ВЛИЯНИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КРОВИ ЖИВОТНЫХ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМОЙ
© 2014 г. А.К. Мартусевич, А.Г. Соловьева, С.П. Перетягин, А.В. Давыдюк
Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Минздрава Pоссии, 603155, Нижний Новгород, Верхне-Волжская наб., 18/1 E-mail: сту$1-таП@уапйех.ги Поступила в p едакцию 17.07.14 г.
Изучена динамика окислительного и энергетического метаболизма и ферментных систем детоксикации крови животных с термической травмой при введении динитрозильных комплексов железа. Показано положительное действие динитрозильных комплексов железа на состояние про- и антиоксидантных систем крови у животных с экспериментальной термической травмой, имеющих выраженный окислительный стресс. Данный эффект проявляется в существенном снижении интенсивности (нормализации) процессов перекисного окисления липидов на фоне значимого нарастания антиоксидантных резервов плазмы крови. Аналогичные тенденции имеют место и в мембранах эритроцитов. Выявлено положительное действие динит-розильных комплексов железа на энергетический метаболизм эритроцитов, реализующееся посредством регуляции активности лактатдегидрогеназы и наблюдающееся уже на третьи сутки послеожогового периода. Установлено, что применение изучаемой депонированной формы NO способствует стимуляции каталитической активности альдегиддегидрогеназы у имеющих термическую травму крыс.
Ключевые слова: динитрозильные комплексы железа, энергетический метаболизм, перекисное окисление липидов, антиоксидантная активность, кровь, альдегиддегидрогеназа.
В настоящее время показаны многочисленные положительные эффекты естественной де-понир ованной формы оксида азота - динитро -зильных комплексов железа (ДНКЖ) - в отношении различных биологических систем [1-5]. Например, была продемонстрирована эффективность их применения при экспериментальном эндометриозе, эректильной дисфункции и других патологиях [3,5]. Ранее в наших исследованиях in vitro установлен характер влияния ДНКЖ на отдельные компоненты метаболизма крови человека, включая энергетический обмен, состояние про- и антиоксидантных систем [6,7] и т.д. Кроме того, получено подтверждение позитивного действия ДНКЖ на энергетический метаболизм эритроцитов при моделиро-вании термической травмы, включавшего преимущественно оптимизацию функционирования лактатдегидрогеназы (ЛДГ) путем стимулиро-вания прямой реакции фермента на фоне ин-гибирования обратной [8]. В то же время ком-
Сокращения: ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа, ЛДГ - лактатдегидрогеназа, К СО - коэффициент субстратного обеспечения, КБЭР - коэффициент баланса энергетических реакций.
плексный анализ влияния рассматр иваемого донора оксида азота на состояние крови при термической травме в литературе не представлен. В связи с этим целью работы явилось изучение динамики окислительного и энергетического метаболизма и ферментных систем детоксикации крови животных с термической травмой при введении ДНКЖ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проводили на 30 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 220250 г, разделенных на три гр уппы равной численности: интактную (никаких манипуляций не проводили, выполняли лишь однократный забор кр ови), контрольную (воспроизводили термическую травму и применяли стандар тное лечение) и основную (аналогичную контрольной, но с дополнительным введением водного раствора ДНКЖ).
Животным контрольной и основной групп комбинированную травму наносили по разработанной ранее методике [9], включающей контактный термический ожог кожи спины (площадь - 20% поверхности тела) в сочетании с
термоингаляционной травмой. Содержание животных, экспериментальные вмешательства осуществляли согласно приказу Минздрава СССР №775 от 12.08.1977 г. Травму наносили под комбинированным наркозом («золетил» + «кси-ла»). Затем крыс разделяли на две равные по численности группы. Животным контрольной группы с первых суток после моделирования термической травмы проводили ежедневные внутрибрюшинные инфузии физиологического раствора (3 мл), раны обрабатывали левомеко-лем. К рысы основной группы ежедневно внут-рибрюшинно получали ДНКЖ в физиологическом растворе (1:9 (по объему) - суммарно 3 мл), местное лечение было аналогично про -водимому в контрольной группе. Продолжительность экспериментальной терапии животных обеих групп составляла 10 сут.
ДНКЖ синтезировали по методике А.Ф. Ванина [10]. Концентрация соединения в физиологическом растворе, определяемая спектро -фотометрически по известной экстинкции при длинах волн 310 и 360 нм, составляла 3,1 ммоль/л.
Контрольными точками в исследовании были выбраны тр етьи и десятые сутки с момента нанесения комбинированной травмы. На третьи (прижизненно) и десятые (при выведении их из эксперимента) сутки отбирали образцы крови у животных обеих групп. К ровь животных стабилизировали 3,8% водным раствором цитр ата натрия в соотношении 1:9. Для получения эрит-роцитарной массы кровь центрифугировали при 3000 об-1 в течение 10 мин. Эритроциты трехкратно отмывали изотоническим р а створом хлорида натрия. Активность оксидоредук-таз и уровень лактата определяли непосредственно после проведения пробоподготовки.
В качестве маркера интенсивности энергетического метаболизма использовали активность лактатдегидрогеназы, а о его направленности судили по соотношению последней в прямой (ЛДГпр) и обратной (ЛДГобр) реакциях. Активность ЛДГ определяли в гемолизате эритроцитов в дистиллир ованной воде (1:40 по объему) по методу Г.А. Кочетова [11]. Уровень лактата в эритроцитах оценивали с помощью автоматического анализатора БирегвЬ Ambu-1апсе. И сходя из полученных значений параметров, рассчитывали интегральные показатели, характеризующие энергетический метаболизм эритроцитов: коэффициент субстратного обеспечения (КСО) и коэффициент баланса энергетических реакций (КБЭР) [7,12]. Ра счет данных показателей производили по следующим формулам:
ЛДГ2
КБЭР=ЛДС10а
где ЛДГпр - активность ЛДГ в прямой реакции, ЛДГобр - активность ЛДГ в обр атной реакции;
КСО = -
Сл
ЛДГ
пр
ЛДГобр '
где Слактат - концентрация лактата в плазме крови, ЛДГпр и ЛДГобр - аналогично предыдущей формуле.
Активность альдегиддегидрогеназы определяли спектрофотометрически по методу Б.М. Кершенгольца и Е.В. Серкиной (1981). Содержание белка уточняли по модифицированному методу Лоури.
В плазме крови и эритроцитах животных всех групп и образцах крови регистрировали интенсивность хемилюминесценции, максимальную фотовспышку и общую антиоксидант-ную активность методом Бе-индуцированной биохемилюминесценции на аппар ате БХЛ-06.
Полученные данные были обработаны статистически с помощью программного пакета 81аЙ81;1са 6.0. Нормальность распр еделения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-кри-терий Краскала-Уоллеса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнительная оценка интенсивности пере-кисного окисления липидов в плазме крови здоровых и имеющих термическую травму животных позволила подтвердить данные о его стимуляции в условиях ожоговой болезни [13]. С огласно рис. 1, повышение ур овня светосуммы индуцированной биохемилюминесценции у крыс с термической травмой по сравнению с интактными составило 67,5% (р < 0,05). В то же время общая антиоксидантная активность плазмы крови животных при нанесении им термической травмы пропор ционально снижается (-47%; р < 0,05) по отношению к здоровым крысам (рис. 2). Результаты исследования со -стояния про- и антиоксидантных систем плазмы крови сонаправлены с данными об интенсивности процессов липопероксидации в мембранах эритр оцитов (рис. 3). Эта динамика четко подтверждает формирование выраженного окислительного стресса у крыс контрольной группы, что обуславливает необходимость его патогенетической коррекции.
Рис. 1. Интенсивность процессов липопероксидации в плазме крови животных (ТТ - крысы, имеющие термическую травму; ТТ+ДНКЖ - животные, которым на фоне термической травмы вводили динитрозильные комплексы железа; * - различия статистически значимы по сравнению с интактными животными p < 0,05; ** - различия статистически значимы по сравнению с ТТ p < 0,05).
Учитывая показанные отечественными и зарубежными исследователями в системах in vitro антиоксидантные свойства ДНКЖ [2,14,15], мы провели внутрибрюшинные инъекции водного раствора данного соединения. Было установлено, что ра ссматриваемый вариант экспер имен-тальной терапии способствует существенному уменьшению интенсивности перекисного окисления липидов (рис. 1), практически достигающему уровня интактных крыс (p < 0,05 по ср авнению с животными контрольной гр уппы; p > 0,05 относительно интактной группы), что косвенно подтверждает наличие антиоксидант-ных эффектов ДНКЖ in vivo.
Оценка действия ДНКЖ на антиоксидант-ную активность плазмы крови продемонстрировала значительное возрастание значения параметра (рис. 2). Это, по нашему мнению, свидетельствует о том, что ДНКЖ не только способны выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов, но и пополнять пул антиокси-дантов биологической жидкости за счет частичного распада до относительно стабильных S-нитрозотиолов и оказывать модулирующее действие на активность антиоксидантных ферментов.
В эритроцитах также выявлено снижение перекисной резистентности (рис. 3), что про -явилось в статистически значимом уменьшении светосуммы хемилюминесценции на 22,8% по ср авнению с интактными животными (p < 0,05). Введение крысам ДНКЖ способствовало по-
Рис. 2. Общая антиоксидантная активность плазмы крови у животных сформированных групп. Обозначения, как на р ис. 1.
Рис. 3. Уровень перекисной резистентности эритроцитов у животных сформированных групп. Обозначения, как на р ис. 1.
вышению перекисной резистентности эритро-цитов на 18,8% по отношению к животным с термической травмой (р < 0,05), причем в этом случае уровень показателя был
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.