ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 2, с. 241-244
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.3
ВЛИЯНИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА НА УРОВЕНЬ NO В ТКАНИ ОРГАНОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО ШОКА © 2015 г. А. А. Тимошин, В. Л. Лакомкин, А. А. Абрамов, Э. К. Рууге, А. Ф. Ванин
Представлено академиком РАН Е.И. Чазовым 26.12.2014 г. Поступило 26.12.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565215140285
Оксид азота (N0) является важным регулятором многих метаболических и физиологических процессов в организме животных и человека [1]. В биологических системах N0 присутствует главным образом в своих депонированных формах: моноядерные и биядерные динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) с различными ли-гандами, а также в виде 8-нитрозотиолов, причем основными физиологическими формами N0 являются именно ДНКЖ [2]. Эти комплексы с низкомолекулярными тиолсодержащими ли-гандами (глутатион — ДНКЖ-Глт, цистеин) могут быть легко синтезированы в лабораторных условиях. При их введении в организм регистрируются продолжительный гипотензивный эффект, кардиопротекторное действие, подавление агрегации тромбоцитов, повышение эластичности эритроцитов и другие положительные эффекты [2, 3].
Известно, что введение этих комплексов в организм интактных животных приводит к повышению уровня свободного N0 [4] и его депонированных форм [5]. Однако ранее нами были получены данные о том, что инъекция ДНКЖ-Глт приводит к подавлению гиперпродукции свободного N0 в условиях региональной ишемии миокарда крыс [6]. Позднее другими авторами на модели культивируемых макрофагов грызунов было установлено, что моноядерные ДНКЖ с N,N,N',N'^^1-раметилэтилендиамином (ДНКЖ-ТМДА), растворенные в органических полярных растворителях, например, в диметилсульфоксиде, способны ослаблять воспалительные процессы в макрофа-
Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва E-mail: timoshin_a_a@mail.ru Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской Академии наук, Москва
гах, индуцированные бактериальными липопо-лисахаридами, что сопровождалось снижением уровня NO [7]. Остается еще неясным вопрос о действии этих комплексов in vivo в условиях генерализованного воспаления.
Целью нашей работы было выяснение механизмов действия ДНКЖ-Глт на уровень NO в ткани органов крыс в условиях его гиперпродукции, вызванной эндотоксическим шоком.
С помощью метода спиновых ловушек исследовали уровень NO в тканях органов крыс в разных физиологических условиях. В качестве спиновой ловушки NO применяли комплексы ионов железа с диэтилдитиокарбаматом (Fe-DETC2) [9]. При этом компоненты ловушки вводили в организм подопытных крыс путем двух раздельных инъекций, в результате чего в гидрофобных областях ткани формировались липофильные комплексы Fe-DETC2. Известно, что такие соединения способны эффективно связывать NO с образованием квазистабильных парамагнитных аддуктов NO-Fe-DETC2, причем данная ловушка может взаимодействовать не только со свободным NO, но также и с их депонированными формами (S-нитро-зотиолы, ДНКЖ) [9].
Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Sprague Dawley (масса тела 350—400 г). Всех животных произвольным образом делили на 4 группы по 5—20 особей в каждой. У крыс первой группы в начале опыта вызывали эндотоксиче-ский шок путем внутривенного введения липопо-лисахаридов (ЛПС, из оболочки бактерий Salmonella typhimurium) в дозе 15 мг/кг массы тела. После этого в разных опытах через 2, 4 или 6 ч животным путем инъекций вводили компоненты спиновой ловушки NO: диэтилдитиокарбамат (DETC, 620 мг/кг массы тела, в 1.0 мл физиологического раствора, внутрибрюшинно) и FeSO4 • ■ 7H2O с цитратом Na (25 и 125 мг/кг массы тела соответственно в 1.0 мл физиологического раствора, подкожно, в область левого плеча). Далее,
_i_i_i_i_i_
320 325 330 335 340
Магнитное поле, мТл
Рис. 1. Спектры ЭПР в тканях сердца, лёгкого, печени и почки крыс контрольной группы после получения ими компонентов спиновой ловушки Fe-DETC2. Температура жидкого азота.
через 20 мин, животных забивали, выделяли их сердце, лёгкое, печень и почку, которые сразу промывали физиологическим раствором и механически измельчали. После этого образцы размельченной ткани этих органов помещали в пластиковые трубки диаметром 5.0 мм, которые быстро замораживали и хранили в жидком азоте. Полученные образцы тканей использовали далее для регистрации их спектров ЭПР.
Животным группы 2 в начале опыта внутривенно вводили раствор ДНКЖ-1лт в дозе 1.6 мкмоль/кг массы тела. Далее через 6 ч этим крысам, как и животным группы 1, вводили компоненты спиновой ловушки и после этого получали образцы ткани их органов, как описано выше. Животным группы 3 предварительно внутривенно вводили дНкЖ-Глт в той же дозе, а через 20 мин — ЛПС в дозе 15 мг/кг массы тела. Через 6 ч им также вводили компоненты спиновой ловушки и получали образцы тканей для проведения их анализа методом ЭПР. Крысам группы 4 (контроль) сразу вводили компоненты спиновой ловушки и затем по стандартной методике получали образцы тканей органов.
Спектры ЭПР всех полученных образцов регистрировали в Х-диапазоне ЭПР на спектрометре Е-109Е ("Varían", США) при температуре жидкого азота. Амплитуда модуляции магнитного поля высокой частоты составляла 0.2 мТл при частоте 100 кГц. Мощность поля сверхвысокой частоты спектрометра устанавливали на уровне 10 мВт, и его частота составляла 9.33 ГГц. Сканирование магнитного поля при записи сигналов ЭПР образцов осуществляли в области g = 2.03. После записи сигналов все образцы размораживали и
[NO-Fe-DETC2], нмоль/г 35 г
Контр. +ЛПС (2 ч) +ЛПС (4 ч) +ЛПС (6 ч)
Рис. 2. Содержание аддукта NO-Fe-DETC2 в контроле, а также через 2, 4 и 6 ч после введения ЛПС. Здесь и на рис. 3 п = 6.
определяли массу ткани в активной зоне резонатора спектрометра.
В работе использовали стандартный препарат "Оксаком", содержащий в качестве активного вещества ДНКЖ-Глт, синтезированный по методике, описанной ранее [8], на Экспериментальном предприятии медико-биологических препаратов ФГБУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Минздрава России. Остальные реактивы были производства '^ша-АШсИ" (США).
Для оценки статистической достоверности использовали критерий t Стьюдента. Результаты представляли в виде М ± т. Кратность повторения опытов составляла не менее 5—6.
На рис. 1 представлены характерные спектры ЭПР всех исследуемых органов крыс (сердце, лёгкое, печень, почка) из контрольной группы. Из рисунка видно, что в них присутствуют узкие компоненты триплетного сигнала в области g = = 2.03, принадлежащего спиновому аддукту NO-Fe-DETC2 [9]. При переходе от контрольных животных к крысам других экспериментальных групп мы наблюдали существенное увеличение амплитуды сигнала NO-Fe-DETC2 (данные не представлены). Для определения количественных значений концентрации NO-Fe-DETC2 в тканевых образцах проводили двойное интегрирование их сигналов с нормировкой на массу ткани в активной зоне резонатора спектрометра и сравнивали полученные значения с аналогичными величинами, соответствующими стандартным образцам с известной концентрацией спинов.
Значения содержания NO-Fe-DETC2, соответствующие показателям животных контрольной
ВЛИЯНИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА
243
группы, представлены на рис. 2. У интактных крыс во всех исследуемых органах происходит формирование этих парамагнитных комплексов, причем их концентрации в ткани исследуемых органов между собой достоверно не различаются.
В результате инъекции ЛПС (рис. 2) мы зарегистрировали существенное увеличение содержания МО-Ре-ВБТС2 во всех исследуемых органах, свидетельствующее об аналогичном росте уровня N0, включая его депонированные формы. При этом наиболее заметный эффект наблюдали в печени. Как было показано ранее, такое увеличение уровня N0 происходит вследствие активации ин-дуцибельной N0-синтазы в условиях воспаления, вызванного инъекцией ЛПС [10]. Из рисунка также видно, что наиболее существенное увеличение уровня N0 в ткани органов происходит в течение первых 4 ч после введения ЛПС, после чего процесс увеличения существенно ослабляется, и к 6 ч содержание N0 в органах практически выходит на плато, достигая при этом своих максимальных значений. Увеличение содержания N0-Fe-DETC2 в тканях органов крыс, получавших ЛПС, по сравнению с контролем было обусловлено ростом уровня N0, образованного с помощью {N08. При этом синтез самих {N08 провоцировался проокси-дантным статусом тканей, инициированным действием ЛПС.
На следующем этапе работы мы исследовали влияние ДНКЖ-Глт, а также совместного действия ЛПС и ДНКЖ-Глт на уровень N0 в тканях органов. На рис. 3 представлены значения содержания N0-Fe-DETC2 в тканях органов животных. Из рисунка видно, что через 6 ч после введения ДНКЖ-Глт в тканях всех исследуемых органов регистрируется более высокий уровень N0 по сравнению с контролем, но он, тем не менее, был существенно ниже, чем в условиях эн-дотоксического шока, вызванного введением ЛПС. В результате последовательного введения ДНКЖ-Глт и ЛПС для сердца и почки уровень общего N0 практически не меняется, а для лёгких и печени мы выявили снижение уровня N0 по сравнению с инъекцией только одного ЛПС.
Вероятно, полученный эффект можно объяснить несколькими причинами. Так, известно, что синтез {N08 запускается в клетках и тканях разными прооксидантами, вызывающими отмену ингибирования транскрипционного фактора регуляции клеточного метаболизма — NFкB, способного после этого индуцировать экспрессию гена, ответственного за синтез {N08 [10]. Именно по такому механизму осуществляется запуск этого процесса у животных, обработанных ЛПС — агентом, инициирующим свободно-радикальные реакции в клетках и тканях. При этом вводимые ДНКЖ-Глт характеризуются хорошо выражен-
[NO-Fe-DETC2], нмоль/г 35
30 25 20 15 10 5
Сердце Лёгкое Печень Почка
Контр. +ЛПС (6 ч) +ДНКЖ (6 ч)
+ДНКЖ +ЛПС (6 ч)
Рис. 3. Содержание аддукта К0^е^ЕТС2 в контроле, а также через 6 ч после инъекции ЛПС, ДНКЖ-Глт и комбинированного введения ДНКЖ-Глт и ЛП
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.