НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 1, с. 46-51
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.8-005:577.175
ВЛИЯНИЕ ДИПЕПТИДА ГЛИЦИЛ-ПРОЛИН НА МЕТАБОЛИЗМ НЕЙРОАКТИВНЫХ АМИНОКИСЛОТ И ПОКАЗАТЕЛИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА В БОЛЬШИХ ПОЛУШАРИЯХ МОЗГА КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА
© 2013 г. Н. З. Башун1*, Е. М. Дорошенко1, Е. Ф. Радута1, Ж. И. Балаш1, Н. П. Канунникова1,
В. П. Голубович2, А. Г. Мойсеенок3
Учреждение образования "Гродненский государственный университет имени Янки Купалы", Гродно, Беларусь
2Государственное учреждение "Институт биоорганической химии НАНБеларуси", Минск, Беларусь 3Государственное учреждение "Научно-производственный центр "Институт фармакологии и биохимии НАН
Беларуси", Гродно, Беларусь
Изучали влияние дипептида "глицил-пролин" (3 мг/кг) на изменения содержания нейроактивных аминокислот (аспартата, глицина, аланина, таурина, ГАМК, глутамата), активности ферментов ГАМК-шунта (ГАМК-трансаминазы, дегидрогеназы янтарного полуальдегида, глутаматдекарбок-силазы) и метаболизма глутамата (глутаматдегидрогеназы, аланин- и аспартат- трансаминаз) в больших полушариях мозга крыс после 6 ч ишемии мозга при трех способах введения препарата: внутрибрюшинном, субконьюктивальном и интраназальном. Установлено, что гли-про проявляет наиболее выраженное корригирующее действие в отношении ишемических нарушений при интра-назальном способе введения.
Ключевые слова: нейроактивные аминокислоты, ишемия мозга, дипептид глицил-пролин.
Б01: 10.7868/81027813312040048
В поддержании функциональной активности ткани мозга в экстремальных условиях важную роль могут играть регуляторные нейропептиды [1—3]. Одним из механизмов реализации разнообразных эффектов нейропептидов является их нормализующее влияние на интенсивность энергетического метаболизма и свободнорадикально-го окисления, что, как правило, сопровождается усилением антиоксидантной защиты, повышением нейрональной активности, оптимизацией когнитивных функций и т.д. [4—8].
Одно из направлений лечебного действия ней-ропептидов — защита ткани мозга от ишемических повреждений [9—13]. Например, выраженным противоишемическим действием обладает синтетический пептид семакс [14]. Существенную роль в определении устойчивости нейронов при ишемии играют нарушения энергетического метаболизма, развитие окислительного стресса и эксайтотоксические эффекты глутамата [15—20]. Окислительный стресс и эксайтотоксичность представляют собой два процесса, взаимно усиливающие друг друга. Связанному с ММЭА-ре-
* Адресат для корреспонденции: 230012 Беларусь, г. Гродно, пер. Доватора, 3/1, e-mail: n.bashun@grsu.by, n.kanunnikova@ grsu.by.
цепторами действию аспартата и глутамата отводится ведущая роль в повреждении нейронов при гипогликемии и ишемии, тогда как внеклеточная ГАМК оказывает защитное действие [21]. Однако участие глутамата не ограничивается его нейро-медиаторными аспектами: глутамат необходим для синтеза тормозного медиатора ГАМК и для включения аминокислот в процессы энергетического метаболизма [22]. Основная реакция, связывающая метаболизм глутамата с циклом три-карбоновых кислот (ЦТК), катализируется глута-матдегидрогеназой (ГДГ), что приводит к образованию 2-оксоглутарата, и, при определенных условиях, уменьшение метаболизма глутама-та через ЦТК может способствовать его накоплению в синаптических окончаниях [22], в связи с чем ключевое значение в подобных ситуациях приобретает сукцинат.
Вместе с реакциями трансаминирования существенную роль в поддержании интенсивной продукции эндогенной янтарной кислоты играют метаболические шунты, связывающие цитозоль-ный и митохондриальный компартменты в нейронах и глии. Особое внимание уделяется возможности образования в ткани мозга сукцината за счет работы ГАМК-шунта, который может обеспечить
не менее 30% от потока субстратов в ЦТК, особенно в экстремальных условиях [21, 22].
Возрастающий интерес к терапевтическому действию природных пептидов, а также искусственных синтетических аналогов, созданных на их основе, обусловливается высокой специфичностью их действия даже при использовании в малых дозах, отсутствием побочных эффектов, низкой токсичностью. Однако возможности применения синтетических пептидов зачастую ограничены их недостаточным проникновением через гематоэнцефалический барьер, что требует изучения эффективности разных способов введения (кроме внутрибрюшинного), облегчающих проникновение в мозг, в частности, интрацере-брального, интрацеребровентрикулярного, ин-траназального, субконъюктивального и др., в связи с чем цель данного исследования — определение показателей энергетического метаболизма, активности ферментов метаболизма ГАМК и глу-тамата, содержания нейроактивных аминокислот в больших полушариях мозга крыс после 6 ч ишемии и коррекции ишемических нарушений в мозге с помощью дипептида глицил-пролина (гли-про) при разных способах его введения в организм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на крысах-самцах линии Ш81аг CRL: (Ш) WUBR массой 180-200 г, полученных при разведении в виварии государственного учреждения " Научно-производствен -ный центр "Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси". Все эксперименты проводились с учетом требований, установленных "Правилами проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных" (Приложение 3), утвержденных Президиумом АН СССР от 2 апреля 1980 г. № 120000-496; положений, предусмотренных рабочей группой Федерации европейского сообщества по науке о лабораторных животных и существующим проектом закона Республики Беларусь о гуманном обращении с лабораторными животными.
Моделирование ишемии мозга осуществляли на фоне тиопенталового наркоза (50 мг/кг, в/бр, за 30-60 мин до операции) путем накладывания двусторонней лигатуры на общие сонные артерии [23]. Развитие тромбоза сосудов предупреждали в/бр введением кальципарина в дозе 125 и.1./кг в момент операции. Контрольным животным производили ложную операцию на фоне тиопентало-вого наркоза.
Декапитацию осуществляли по истечении 6 ч ишемии, немедленно извлекали мозг, выделяли большие полушария (БП), в которых изучали биохимические показатели, так как в данной мо-
дели ишемии мозга наиболее выраженные изменения показателей энергетического метаболизма и окислительного стресса наблюдаются в этой структуре [24, 25].
Активность глутаматдекарбоксилазы (КФ 4.1.1.15, ГДК), ГАМК-аминотрансферазы (ГАМК-Т, КФ 2.6.1.19) [26] и дегидрогеназы янтарного полуальдегида (ЯПА-ДГ, КФ 1.2.1.24) определяли флуо-риметрическими методами с небольшими модификациями [27]. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1) [28] и 2-оксоглутаратдегидроге-назы (2-ОГДГ, КФ 1.2.4.2.) [29, 30] в митохондри-ально-синаптосомальной фракции БП определяли спектрофотометрическим методом. Активность глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.2) также определяли спектрофотометрическим методом с использованием 2-оксоглутарата в качестве субстрата [31]. Активности ферментов аспар-татаминотрансферазы (АСТ, КФ 2.6.1.1.) и алани-наминотрансферазы (АЛТ, КФ 2.6.1.2.) определяли в митохондриально-синаптосомаль-ной фракции БП спектрофотометрически [25] с помощью наборов фирмы "АСТ-РФ-Ольвекс" и "АЛТ-РФ-Ольвекс" (Россия).
Для определения аминокислот ткани гомогенизировали 1 : 10 (масса/объем) в 0.2 М хлорной кислоте, содержащей 20 мг/л ЭДТА, 20 мг/л мета-бисульфита Na и 0.2 мМ дельта-аминовалериано-вой кислоты (внутренний стандарт), после чего центрифугировали на холоде при 20000 g 15 мин. Определение свободных аминокислот проводили методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоноч-ной дериватизацией аминокислот в безбелковых хлорнокислых экстрактах тканей на колонке Zor-bax Eclipse XDB C8 3.5 мкм, 2.1 x 150 мм в режиме градиентного элюирования. Температура колонки 37°С, скорость потока 0.2 мл/мин. Предколо-ночную дериватизацию образцов осуществляли смешиванием пробы с раствором 0.3% ортофта-левого альдегида и 0.3% 3-меркаптопропионовой кислоты в 0.4 М Na-боратном буфере pH 9.4 в соотношении 1 : 5, затем пробу нейтрализовали добавлением 8 частей 0.2 М раствора хлорной кислоты и немедленно вводили в колонку. Подвижная фаза А: 0.1 М Na-ацетатный буфер, рН 5.7, 20 мг/л ЭДТА и 20 мг/л азида натрия. Подвижная фаза В: 70% (об/об) раствор ацетонитрила. Профиль градиента: 0 мин — 4.3% В, 36 мин — 14.6% В, 64 мин - 28.8% В, 75 мин - 39% В, 79 мин - 100% В. Детектирование по флуоресценции (231/445 нм) [32]. Данный способ позволяет разделить полный спектр свободных аминокислот, присутствующих в ткани мозга, однако в связи с отсутствием достоверных изменений в ЦНС экспериментальных животных в использованной модели ишемии уровня большинства аминокислот, в работе приводятся только цифры, характеризующие уровень нейроактивных аминокислот - аспартата, глута-
Таблица 1. Активность ферментов метаболизма ГАМК в БП мозга крыс при 6-часовой ишемии и разных способах введения дипептида гли-про
Группы ГДК, нмоль/мг белка* ч ГАМК-Т, нмоль/мг белка* ч ЯПА-ДГ, нмоль/мг белка* ч
Контроль 24.13 ± 2.21 302.9 ± 38.1 720.3 ± 56.0
Контроль + гли-про (в/бр) 27.55 ± 0.99 300.9 ± 19.9 687.9 ± 66.5
Контроль + гли-про (с/к) 30.77 ± 2.90 267.4 ± 33.1 717.6 ± 31.5
Контроль + гли-про (и/н) 25.65 ± 2.32 289.4 ± 31.9 706.5 ± 43.8
Ишемия 6 ч 32.18 ± 1.43* 221.1 ± 13.4* 648.6 ± 45.6
Ишемия 6 ч + гли-про (в/бр) 25.1 ± 1.02# 267.6 ± 24.9 711.4 ± 70.2
Ишемия 6 ч + гли-про (с/к) 30.4 ± 2.12 300.7 ± 45.2# 640.4 ± 34.2*
Ишемия 6 ч + гли-про (и/н) 30.98 ± 0.99* 261.8 ± 20.6 670.7 ± 71.4
Примечание: * — р < 0.05 по сравнению с интактным контролем; # — р < 0.05 по сравнению с группой ишемии; *р < 0.05 по сравнению со своим контролем.
мата, глутамина, глицина, аланина, таурина, ГАМК.
Белок в гомогенате измеряли по методу Hartree [33]. Для статистической обработки и графического представления полученных результатов использованы пакеты программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel 2003. Значения количественных признаков приведены в виде M ± m, где M — среднее выборочное, m — ошибка среднего. Различия считали значимыми приp < 0.05. В каждой группе находил
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.