ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 139-146
УДК 577.154.3
ВЛИЯНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ТИОЛОВЫХ ГРУПП В МОЛЕКУЛЕ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ИЗ Aspergillus awamori НА ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ И КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА
© 2014 г. М. А. Суржик*, **, А. Е. Шмидт*, **, Е. А. Глазунов**, Д. Л. Фирсов*, М. Г. Петухов*, **
*Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова, НИЦ "Курчатовский институт"Ленинградская обл., г. Гатчина 188300 ** Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Институт физики, нанотехнологий и телекоммуникаций, г. Санкт-Петербург 195251 e-mail: surgik@yandex.ru Поступила в редакцию 12.08.2013 г.
Пять мутантных форм глюкоамилазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori с искусственными дисульфидными связями (4D-G137A\A14C, 6D-A14C\Y419C\G137A, 10D-V13C\G396C, 11D-V13C\G396C\A14C\Y419C\G137A, 20D-G137A\A246C\A14C) были сконструированы с помощью компьютерного моделирования и экспериментально протестированы на термостабильность. Введение двух дисульфидных связей между первой и тринадцатой а-спиралями, а также петлей, расположенной близко к каталитическому остатку E400, позволило оценить влияние дополнительных дисульфидных мостиков на термостабильность белка. Мутантные белки с комбинированными аминокислотами заменами G137A\A14C, V13C\G396C\A14C\Y419C\G137A и G137A\A246C\A14C отличались повышенной термостабильностью по сравнению с белком дикого типа. В то же время новые дисульфидные мостики в мутантных белках A14C\Y419C\G137A и V13C\G396C привели к дестабилизации их структуры и потере термостабильности.
DOI: 10.7868/S0555109914020184
Рациональное конструирование промышлен-но важных ферментов, имеющих высокую активность, специфичность и термостабильность при заданных условиях среды (температура, pH, давление, ионная сила и т.д.), имеет не только большое практическое значение, но и способно прояснить многие вопросы, связанные с самопроизвольным сворачиванием белков в уникальную биологически активную конформацию и молекулярными механизмами их действия. Одним из наиболее широко используемых ферментов в мировой промышленности при производстве биоэтанола является нетермостабильная глюкоамилаза из мицелиального гриба Aspergillus awamori X100.
Глюкоамилаза (1,4-a-D-глюкан-глюкогидро-лаза, КФ 3.2.1.3) катализирует гидролиз a-1,4 гликозидных связей с отщеплением глюкозных остатков с невосстанавливающихся концов крахмала, гликогена, мальтоолигосахаридов. Фермент активен в интервале температур 55—60°C. При более высоких температурах белок необратимо инактивируется.
Глюкоамилаза (ГА) широко используется в биотехнологических процессах получения фрук-
тозы и этанола из кукурузного крахмала [2]. На первой стадии этого процесса, когда происходит обработка субстрата, термостабильная а-амилаза гидролизует крахмал до мальтоолигосахаридов при температурах 95—105°С. На следующей стадии нетермостабильная ГА работает при 55—60°С, поэтому в технологический процесс требуется введение промежуточного этапа — охлаждение разжиженного продукта до нужных рабочих температур. Это приводит к потере времени и энергии, а следовательно снижает эффективность производства и вызывает удорожание конечного продукта. Получение термостабильной формы ГА, способной работать при температуре 95—100°С, позволило бы сократить технологический процесс до одной стадии, кроме того, такой одностадийный процесс при максимально высоких температурах позволит увеличить скорость реакции и удешевить стоимость конечного продукта.
В начале 90-х годов впервые была определена трехмерная структура ГА из гриба А. ататоп Х100 и ряда ее комплексов с лигандами [3, 4]. Это позволило детально исследовать механизм ее действия и, как следствие, получить возможность направленно изменять структуру молекулы для
улучшения ее технологических характеристик [5, 6]. Одним из способов увеличения термостабильности ферментов является введение дополнительных дисульфидных связей в структуру белка [7, 8], хотя это не всегда приводит к увеличению термостабильности [9].
В результате проведения точечных аминокислотных замен было показано, что для ГА наиболее успешными оказались замены A246C [10], N20C\A27C [11], A276C\S347C и S298C\l354C [12], которые приводили к образованию дополнительных дисульфидных мостиков. Все эти му-тантные формы ГА значительно превосходили по термостабильности белок дикого типа.
В предыдущей работе [13] исследовали влияние модификаций в а-спирали 4 на термостабильность ГА, а также сконструировали двойной мутант по гену GA, приводящий к синтезу белка, несущего замены G137 и A246C (вариант 3D). Последний вариант ГА оказался значительно термостабильнее, чем фермент дикого типа.
Цель работы — изучение влияния дополнительно введенных в состав молекулы ГА из A. awamori тиоловых групп и образовавшихся искусственных дисульфидных мостиков на термостабильность фермента.
МЕТОДИКА
Молекулярное моделирование. Регуляризован-ная пространственная структура каталитического домена ГА, последовательность которого закодирована на используемой нами плазмиде YepPM18, была построена по гомологии с известной пространственной структурой ГА из банка данных PDB (код структуры: 1GAH) с помощью процедур и стандартных протоколов ICM-Pro, коммерчески доступного пакета программ для молекулярного моделирования белков [14]. Конструирование му-тантных форм ГА проводили с помощью программы Disulfide by Design Version 1.2 [15] с использованием стандартных параметров этой программы. Энергетические вычисления были выполнены с помощью ICM-Pro с использованием силового поля ECEPP/2 [16]. При молекулярном моделировании аминокислотные остатки белка включали все атомы, в том числе и атомы водорода (полноатомное приближение). Во время энергетических вычислений и минимизации энергии длины углы валентных связей были фиксированы в их стандартных величинах. Ван-дер-Ваальсовы и электростатические взаимодействия, а также водородные связи и торсионные потенциалы были включены в энергетические расчеты. Для того чтобы избежать необходимости регулярных обновлений списков взаимодействия во время энергетических вычислений, мы использовали полный список невалентных взаимодействий белка.
Плазмиды, клеточные линии, сайт-направленный мутагенез. Для генетических манипуляций в работе использовали штаммы E. coli DH5a и Sac-charomyces cerevisiae C468 генотипа MdATa leu2-3, 112 his3-11,15. Ген GA1 гриба A. awamori, кодирующий изучаемую ГА, включен в плазмиду эписо-много типа YepPM18, которая помимо этого несет прототрофную аллель дрожжевого гена LEU2. Это позволяет отбирать дрожжевые трансформанты по признаку лейциннезависимости. Дрожжевой штамм С468 и плазмида YepPM18 получены нами из лаборатории проф. П.Д. Рейли университета штата Айова (Эймс, США).
Для введения нуклеотидных замен в кодирующую последовательность гена GA1 использовали стандартный набор "QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene, США). Мутагенез проводили с помощью ПЦР с использованием 2.5 единиц Pfu-полимеразы, 120 нг прямого и обратных праймеров и 10 нг кДНК гена GA1 в 50 мкл реакционной смеси по следующей программе: 20 циклов денатурации при 95°C в течение 1 мин и синтеза при 68° C в течение 12 мин. Наличие введенных мутаций в конечных конструкциях проверяли секвенированием.
Для экспрессии мутантных форм гена GA соответствующие варианты плазмиды YepPM18 выделяли из клеток E. coli DH5a методом щелочного лизиса и трансформировали в дрожжевой штамм S. cerevisiae С468. Трансформанты отбирали по признаку лейциннезависимости на селективной среде, не содержащей лейцина.
Для выращивания клеток кишечной палочки, содержащих плазмиду YepPM18, использовали стандартную среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина [17]. В работе с дрожжевыми штаммами использовали стандартные среды полного и минимального состава [18]. При приготовлении минимальной среды использовали препарат "Yeast Nitrogen Base" фирмы "Difco" (США), который содержит весь необходимый набор солей, витаминов и микроэлементов. При выращивании дрожжевых трансформантов в минимальную среду добавляли гистидин из расчета 20 мг/л.
Выделение и очистка ГА. Культуру дрожжевых трансформантов выращивали в 2 л жидкой дрожжевой минимальной среды при температуре 30°C в течение 5—6 сут с перемешиванием на шейкере. По окончании культивирования среду охлаждали до 4°C и центрифугировали при 4000 g в течение 15 мин. Осадок отбрасывали, рН супернатанта доводили до 7.0 добавлением 1.7 М трис-HCl (pH 7.6). Полученный раствор пропускали через колонку с ДЭАЭ-сефарозой. Фермент элюирова-ли градиентом NaCl от 0.05 М до 0.5 М в 0.05 М трис-буфере с рН 7.5. Фракции, содержащие глю-коамилазу, объединяли и диализовали против 0.05 М ацетатного буфера рН 4.5 с добавлением
0.5 М NaCl. Далее проводили препаративную аффинную хроматографию на колонке объемом 5 мл с носителем акарбозо-сефарозой используя метод [19]. Сорбированный белок смывали 1.7 М трис-буфером, рН 7.6. Фракции, содержащие ГА, объединяли и диализовали против 0.05 М Na-аце-татного буфера, рН 4.5, содержащего 0.05 М NaCl.
Определение активности фермента. Для определения ферментативной активности измеряли количество глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы в 0.05 М Na-ацетатном буфере при рН 4.5 и температуре 50°C за 1 мин при концентрации субстрата — мальтозы, значительно превышающей величину KM. Реакцию останавливали охлаждением проб в жидком азоте. Концентрацию образовавшейся в ходе реакции глюкозы измеряли с помощью гексокиназной системы (КлиниТест-Глюкоза ГК 100 "ЭКО сервис", Россия).
Исследование термостабильности ферментов. В качестве основного критерия термостабильности фермента исследовали температурные зависимости констант его термоинактивации. Раствор фермента инкубировали при заданной температуре и через определенные промежутки времени отбирали пробы, которые немедленно охлаждали в ледяной бане до 0°C и хранили при 4°C в течение 24 ч. Затем в каждой пробе определяли остаточную активность фермента при стандартной температуре 50°C. Константу термоинактивации фермента, Кинак вычисляли как тан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.