БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2004, том 30, № 6, с. 483-485
УДК 576.1 МОРСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ МЯГКОГО КОРАЛЛА LOBOPHYTUM PAUCIFLORUM НА ТРОФОЗОИТОВ ENTAMOEBA HISTOLYTICA IN VITRO И IN VIVO1
© 2004 г. Ш. Гошал1, В. Лакшми2
1Отделение микробиологии и 2Отделение химии Центрального института исследования лекарств, Лаккноу-226001, Индия e-mail: vijailakshmi@rediff.com
Статья принята к печати 26.02.2004 г.
Установлено, что метанольные экстракты из морского коралла Lobophytum pauciflorum в условиях in vitro оказывают амебоцидное действие на трофозоитов Entamoeba histolytica и в 85% случаев излечивают амебиаз слепой кишки у крыс. Обнаруженная активность характерна для n-бутанольной фракции, из которой были выделены три чистых соединения.
Ключевые слова: амебоцидное действие, Entamoeba histolytica, амебиаз слепой кишки, Lobophytum pauciflorum.
Activity of soft coral Lobophytum pauciflorum extract against Entamoeba histolytica in vitro and in vivo.
S. Ghoshal1, V. Lakshmi2 ^Division of Microbiology and 2Division of Chemistry, Central Drug Research Institute, Lucknow-226001, India)
Methanol extracts of the marine coral Lobophytum pauciflorum showed in vitro amoebicidal activity against trophozoites of Entamoeba histolytica and effected 85% cures of caecal amoebiasis in rats. The activity was localized in the n-butanol fraction, from which three pure compounds were isolated. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2004, vol. 30, no. 6, pp. 483-485).
Key words: amoebicidal activity, Entamoeba histolytica, caecal amoebiasis, Lobophytum pauciflorum.
Поражение кишечника человека амебой Entamoeba histolytica вызывает снижение трудоспособности, ухудшает качество жизни и уровень деловой активности людей в странах с теплым климатом. Высокая частота встречаемости этого заболевания в мире регистрируется на протяжении длительного периода времени (Beltran, 1948; Stanley, 2003). Данное заболевание представляет большую проблему для национальных медицинских и профилактических программ.
Для борьбы с этим заболеванием используют ряд терапевтических средств, обладающих потенциальной активностью против трофозоитов E. histolytica в условиях in vitro. Однако применяемые средства достаточно токсичны и обеспечивают лишь симптоматическое облегчение. Новые соединения с амебоцидной активностью были получены из наземных растений и морских организмов, круг природных объектов постоянно расширяется за счет морской биоты.
Альционарии являются богатым источником сесквитер-пенов и дитерпенов. Мягкий коралл Lobophytum pauciflorum с Индийского побережья исследовался разными специалистами в Индии и вызвал значительный интерес как источник таких производных (Anjaneyulu, Babu, 1992; Raju et al., 1993). Настоящее сообщение рассматривает амебоцидную активность морского коралла L. pauciflorum в отношении трофозоитов E. histolytica в условиях in vitro и при экспериментальном аме-биазе слепой кишки у крыс.
Материал и методика. Морской коралл Lobophytum pauciflorum собирали на побережье Южного Андамана в октябре. Его образец хранится в Отделении ботаники института под серийным ботаническим номером 164.
Свежесобранные кораллы (2.0 кг) тщательно промывали водой, разделяли на небольшие части, замачивали на ночь в метаноле (6 л), отфильтровывали и экстрагировали метано-
1 Перевод С.В. Хотимченко.
лом (4 раза по 6 л). Объединенный метанольный экстракт концентрировали при пониженном давлении до вязкой массы, которую высушивали в вакууме в течение 3 ч для удаления следов растворителя. Приготовленный таким образом метанольный экстракт (32.2 г) оценивали на противоамебную активность. Затем кораллы вымачивали в 50% растворе метанол-хлороформа (5 раз по 6 л), объединенный экстракт концентрировали при пониженном давлении до вязкой массы, которую высушивали в вакууме (20 г). Полученные экстракты фракционировали путем последовательного растворения в гексане, хлороформе и n-бутаноле. Три чистых соединения, выделенных из активной фракции хроматографией, исследовали на противоамебную активность.
В данном исследовании использовали стерильно растущие культуры E. histolytica (200, NIH), содержавшиеся в среде TYI-S-33 (Diamond et al., 1978), и септическую культуру (VP), полученную из инфицированного фекального материала при остром случае амебной дизентерии и содержавшуюся в среде Робинсона (Robinson, 1968).
Трофозоиты амебы (200, NIH) из культуры возрастом 24 ч подсчитывали на гемоцитометре, доводили до концентрации 1000 трофозоитов в 0.1 мл и использовали для исследований in vitro. Живых трофозоитов (VP) из культуры возрастом 48 ч промывали методом низкоскоростного центрифугирования свежей средой Робинсона. Осадок помещали в свежую среду для обеспечения жизнеспособности трофозои-тов, подсчитанных на гемоцитометре, доводили до концентрации около 105 трофозоитов в 0.2-0.3 мл и использовали для инокуляции в слепую кишку крыс.
Действие исследуемых соединений in vitro оценивали по методу Дас (Das, 1975). Рабочий раствор тестируемого агента готовили путем его растворения в небольшом количе-
484
ГОШАЛ, ЛАКШМИ
стве диметилсульфоксида, к которому добавляли три объема дистиллированной воды, чтобы получить необходимую концентрацию. Дальнейшие разведения готовили из рабочего раствора и дистиллированной воды. Амебный инокулят (0.1 мл), содержащий около 1000 трофозоитов, вводили в угловые лунки трех предметных стекол. В каждую лунку добавляли исследуемый агент (0.1 мл) с известным разведением, маркировали и запечатывали покровной лентой. Наблюдения проводили под микроскопом с увеличением 10 х 10. После первоначальных наблюдений предметные стекла инкубировали при температуре 37°С. Эффективность исследуемых агентов регистрировали через 24 и 48 ч. Живые амебы были подвижными и отличались от круглых, вакуолизированных и сжатых мертвых трофозоитов. В качестве стандартного препарата использовали метронидазол. Для каждой концентрации тестируемых веществ исследовали две повторности.
Белые неполовозрелые крысы линии Дракрэй возрастом 21 сут обоего пола массой около 25 г были получены из вивария института. Животным был обеспечен свободный доступ к пище и воде. В течение 7 сут до инвазирования крысы получали автоклавированную рисовую диету. Кислотность содержимого слепой кишки крыс поддерживали на уровне рН от 5.5 до 7.0 при отсутствии свободного аммиака, токсичного для данной амебы (Krishna Prasad, Bansal, 1983; Leitch, 1988), что способствовало стойкому развитию инвазии в слепой кишке. Крысам под легким эфирным наркозом в слепую кишку вводили 0.2-0.3 мл инокулята амеб, содержащего 105 трофозоитов E. histolytica, после чего на рану накладывали абдоминальный шов. Через 48 ч инвазированные крысы были готовы для терапевтической оценки исследуемых соединений, поскольку трофозоиты E. histolytica были видны микроскопически в содержимом и в соскобах стенки толстой кишки.
Тестируемый материал находился в виде суспензии камеди акации в дистиллированной воде. Исследуемые вещества вводили крысам перорально в дозе 900 мг/кг с помощью зонда ежедневно в течение 5 сут. Через 48 ч после введения последней дозы тестируемого материала крыс умерщвляли с помощью высокой дозы эфирного наркоза, слепую кишку исследовали на наличие трофозоитов E. histolytica. Для оценки степени инвазии использовали метод, описанный ранее (Neal, 1951).
Результаты и обсуждение. Результаты воздействия экстракта из Lobophytum pauciflorum на трофозоиты Entamoeba histolytica в условиях in vitro и при амебиазе слепой кишки у крыс приведены в таблице. Эффективность in vitro зарегистрирована у всех исследованных образцов, включая чистые соединения. Интересные дозозависимые результаты получены при оценке терапевтической активности мета-нольных экстрактов в условиях in vitro. Отмечено, что мета-нольный экстракт, назначаемый в дозе 100 мг/кг массы тела в течение 5 сут, был эффективен в 75% случаев, в то же время уровень полного излечения возрастал до 85% при введении дозы 150 мг/кг. n-Бутанольная фракция метанольного экстракта оказалась наиболее эффективной, так как уровень излечения составил 83% при дозе 100 мг/кг. Следует отметить, что фракция в дозе 50 мг/кг не приводила к иррадикации амебных трофозоитов из толстого кишечника крыс, однако их количество в кишечной стенке и содержимом кишки значительно снижалось. Это свидетельствует о том, что данная фракция ингибирует колонизацию амебами слепой кишки ин-вазированных крыс. Таким образом, полученные данные указывают на возможное наличие активного компонента в этой фракции, хотя результаты исследований in vitro и in vivo трех чистых образцов, выделенных из фракции n-бутанола, не обнаружили достоверной корреляции. Все они оказывали аме-боцидное действие in vitro (31.2-62.5 мкл/мл), но не были эффективны в условиях in vivo.
Достоверные результаты получены в отношении состояния стенки слепой кишки. Слепая кишка у крыс, которым вводили метанольный экстракт и фракцию n-бутанола, визуально не отличалась от таковой у крыс, получавших стандартный препарат метронидазол (100 мг/кг массы тела). Однако содержимое слепой кишки у крыс, пролеченных исследуемыми агентами, хотя и было нормальным, оказалось менее оформленным, чем у крыс, получавших метронидазол. Более интересные результаты мы наблюдали при сравнении слепой кишки пролеченных и нелеченых крыс. У последних слепая кишка была бесформенной, с язвами на слизистой оболочке стенки и с очень малым количеством фекального вещества в содержимом.
Эффекты различных компонентов, полученных из Lobophytum pauciflorum, in vitro и при экспериментальном амебиазе слепой кишки у крыс
Компонент Активность in vitro, мкг/мл Доза, мг/кг Слепокишечный амебиаз у крыс
кол-во крыс пролеченный/ вылеченный (%) средний показатель инвазии*
стенка кишки содержимое кишки всего
Метанольный экстракт 2S0 100 19/14 (7S) 1.1 0.3 1.4
1S0 14/12 (8S) 0.3 0.1 0.4
Фракция гексана 2S0 100 2S/17 (б8) 0.7 2.0 2.7
Фракция хлороформа 2S0 100 4/1 (2S) 2.0 1.2 3.2
и-Бутанол растворимая фракция 12S SO 8/0 (0) 1.1 0.25 1.3S
100 12/10 (83) 0.25 0.25 0.S
и-Бутанол нера
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.