= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1:577.214.625:578.853
ВЛИЯНИЕ ЭКТОПИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА NtEXPA5 НА РАЗМЕРЫ КЛЕТОК И РОСТ ОРГАНОВ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА
© 2013 г. Б. Р. Кулуев, М. Г. Сафиуллина, А. В. Князев, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054 Уфа, ул. Проспект Октября, д. 71
E-mail: kuluev@bk.ru
Поступила в редакцию 10.10.11 г.
Окончательный вариант получен 16.12.11 г.
Получены трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие ген NtEXPA5, кодирующего а-экс-пансин Nicotiana tabacum. Трансгенные растения характеризовались увеличением размеров листьев и стеблей, при этом величина цветков оставалась практически неизменной. Увеличение размеров органов было обусловлено стимулированием только клеточного растяжения, при этом число клеточных делений даже уменьшалось. Полученные данные свидетельствуют о тесном взаимодействии регуляции клеточного растяжения и клеточного деления, которые вместе являются основными механизмами контроля величины органов растений.
Ключевые слова: экспансины, клеточное растяжение, клеточное деление, величина органов, №ЕХРА5, сверхэкспрессия, трансгенные растения, ШевНапа ?аЬаеиш.
DOI: 10.7868/S0475145013010059
ВВЕДЕНИЕ
Во многих морфогенетических процессах у растений, которые регулируются фитогормонами и множеством белковых факторов, важная роль принадлежит экспансинам. Экспансины — белки, участвующие в разрыве нековалентных связей между целлюлозными микрофибриллами и глика-новыми поперечными мостиками (см. обзор Шаровой, 2007). Благодаря своим способностям разрыхлять клеточную стенку, экспансины стимулируют клеточное растяжение и таким образом участвуют в контроле роста всех органов растений. Было показано, что экспансины участвуют в регуляции таких физиологических процессов, как прорастание семени, развитие корня и листа, размягчение плодов, ответные реакции на стресс и многих других. Экспансины являются консервативными щелочными белками, непосредственно не обладающими ферментативной активностью, при этом они подразделяются на а- и Р-экспанси-ны, сходство между последовательностями нук-леотидов которых составляет 20—40%, а топологическое сходство третичной структуры доходит до 75%. Анализ промоторов генов экспансинов риса показал наличие доменов связывания с ауксинами, гиббереллинами, брассиностероидами, цито-кининами и этиленом (Lee et al., 2001). Таким образом, экспрессия экспансинов контролируется
многими фитогормонами, которые служат сигнальными молекулами при регуляции формообразовательных и деструктивных процессов в растениях (Azeez et al., 2010; Park et al., 2010). Кроме экспансинов в регуляции клеточного растяжения участвуют большое количество других белковых факторов, таких как ARL (Hu et al., 2006), GRF5 (Horiguchi et al., 2005), XET (Nishikubo et al., 2007) и другие. Эти белковые факторы и фитогормоны функционируют совместно, формируя сложную сеть клеточной сигнализации, контролирующей клеточное растяжение. При этом процессы клеточного растяжения и клеточного деления тесно связаны друг с другом через многочисленные точки взаимодействия сигнальных молекул (Horiguchi et al., 2005).
В каждом растении присутствуют большое количество разнообразных экспансинов, но лишь у немногих растений они идентифицированы и определены их функции. Например, в геноме ара-бидопсиса было обнаружено 26 генов а-экспанси-нов и пять Р-экспансинов, в геноме риса — 26 генов а- и 14 генов Р-экспансинов (Cosgrove etal., 1997).
Одним из эффективных методов изучения экспансинов является получение трансгенных форм с повышенным или пониженным уровнем экспрессии целевых генов и проведение морфофизиоло-
гического анализа опытных растений в сравнении с контрольными (Cho et al., 2000). Таким способом, например, было показано, что повышенная экспрессия гена AtEXPA1 арабидопсиса приводит к задержке роста побегов, особенно в ранней фазе вегетативного роста (Гао и др., 2010). Трансгенные по гену AtEXPA10 растения характеризовались увеличением длины черешков и площади листовой пластинки (Cho et al., 2000). Эктопическая экспрессия гена PttEXPA1 осины (Populus tremula L. х х P. tremuloides Michx.) способствовала увеличению размеров междоузлий и площади листьев (Gray-Mitsumune et al., 2008). Таких исследований с каждым годом становится все больше, при этом наиболее частым фенотипическим проявлением сверхэкспрессии экспансинов является увеличение размеров клеток растений. Что касается табака, то у него на данный момент идентифицировано лишь 6 генов а-экспансинов (Link et al., 1998), которые получили названия NtEXPA, с порядковыми номерами от 1 до 6, и их нуклеотидные последовательности имеются в GenBank (AF049350— AF049355). Эксперименты по получению трансгенных растений табака с измененным уровнем экспрессии данных экспансинов не проводились, поэтому точно не известно, за какие процессы они несут ответственность в организме табака. Наличие в геноме растений большого количества генов различных экспансинов пока не находит точного объяснения, поэтому представляет большой интерес изучение их по отдельности, с целью выяснения функции каждого из них. В данной работе в качестве объекта исследования нами был выбран ген NtEXPA5 табака. С целью изучения влияния эктопической экспрессии этого экспансина на величину органов и отдельных клеток, нами были получены трансгенные растения табака, с повышенным уровнем экспрессии целевого гена. Предполагалось, что трансгенные по гену NtEXPA5 растения табака за счет увеличения размеров клеток, будут отличаться большими размерами органов. Однако изначально было неясно, какие именно органы будут преимущественно увеличиваться.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Бактериальные клетки, штаммы, плазмиды, генно-инженерные манипуляции
В работе использованы бактерии E. coli штамма XL1-Blue и A. tumefaciens штамма AGL0. Из плаз-мид использовали Т-вектор pKRX и бинарный вектор pCambia 1301 с геном устойчивости к гигро-мицину и репортерным геном GUS (CAMBIA, Австралия). В вектор pCambia 1301 по сайту SmaI была дополнительно вставлена 35S кассета, состоящая из 35S промотора и сайта полиадени-лирования. Геномную ДНК табака выделяли методом солевой экстракции (Aljanabi et al., 1997). Тотальную РНК выделяли тризолом фирмы Invitro-
gen (США). ОТ-ПЦР осуществляли при помощи MuLV-обратной транскриптазы (Fermentas, Литва). Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса бактериальных колоний используя наборы фирмы Цитокин (Россия). Качество и количество выделенных препаратов определяли аналитическим электрофорезом в 1% агарозном геле. Агарозный гель-электрофорез проводили в приборах модели Sub-Cell GT WIDE MINI (BioRad, США). Для ПЦР использовали амплифика-торы производства компании "ДНК-технология" (Россия). Ген NtEXPA5 выделили из тотальной ДНК табака при помощи праймеров NtEXPF ACAATGGCAACATTCTCCATTATCTC и
NtEXPR CTACTTAATTAAAATTGAGCCCc. Для ОТ-ПЦР гена NtEXPA5 использовали праймеры ATTCAACAATGGTTTAACATGTG и TTGC-CATCCAGTATTAGACCCTTTA. Для получения ампликонов с "тупыми" концами использовали Pfu ДНК-полимеразу (Сибэнзим, Россия), для "затупления" липких концов после рестрикции или амплификации использовали Т4-ДНК-поли-меразу (Сибэнзим, Россия). Для поиска целевых клонов при лигировании в векторе pCambia 1301 использовали праймер 35SCambF: AGAGGAC-CTAACAGAACTCG в паре с праймером 1301R TGCTCTAGCATTCGCCATTC. Из целевых генно-инженерных конструкций нарабатывались специфичные ампликоны при ПЦР только в случае сочетания следующих пар прай-меров: 35SCambF/NtEXPR, NtEXPF/1301R, 35SCambF/1301R, а при сочетании пар 35SCambF/NtEXPF, NtEXPR/1301R амплификация проходила лишь в случае антисмысловой ориентации гена NtEXPA5. После полной проверки полученный бинарный вектор с геном NtEXPA5 под контролем 35S промотора вводили в клетки A. tumefaciens методом электропорации при помощи прибора фирмы Bio-Rad модели Micropulser. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе "ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, США). Поиск гомологичных генов осуществляли при помощи программы MegAlign пакета Lasergene (DNASTAR, США) и программы MegaBlast, доступной через сайт http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей открытых рамок считывания генов экспансинов и построения филогенетического древа использовали метод CLUSTALW (программа MegAlign).
Получение трансгенных растений табака,
морфологическая характеристика и условия выращивания растений
Трансгенные формы табака (Nicotiana tabacum L. Petit Havana SR-1) получали методом агробакте-риальной трансформации листовых дисков, для получения которых использовали листья растений
3-месячного возраста. Первичные трансгенные Т0-побеги отбирали на селективной среде (соли среды МС с добавлением 1 мг/л 6-БАП, 0.1 мг/л НУК), содержащей 25 мг/л гигромицина (Hyg). Качественную оценку активности репортерного гена GUS в листьях Т0-побегов определяли гисто-химически, используя субстрат X-Gluc (натриевая соль 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета^-глюкуро-новой кислоты, Fermentas). Образцы ткани листьев инкубировали в течение ночи при 37°C в 0.1% растворе X-Gluc, содержащем 0.1 М натриевый фосфатный буфер (pH 7.0), 10 мМ Na2EDTA и 0.1% Triton X-100. После инкубации с гистохимическим реактивом в течение ночи, зеленые ткани отбеливались обработкой 70% этанолом и исследовались под стереомикроскопом на наличие синей окраски. Все полученные Т0 GUS+ побеги каждого варианта укореняли в присутствии 25 мг/л Hyg, затем переносили в почвенную смесь, доводили до цветения, самоопыляли и получали семена (Т1 потомство).
Для контроля наследования трансгенов и определения количества вставок, часть Т1 семян каждой полученной линии поверхностно стерилизовали последовательным погружением в 70% спирт, 5% раствор гипохлорита натрия, промывали в стерильной дистиллированной воде и проращивали на среде МС с добавлением гигромицина в климатической камере Binder (Германия). Через 3 недели производили подсчет устойчивых и неустойчивых к селективному агенту сеянцев и определяли расщепление при наследовании гена селективного м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.