МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 417-421
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.22
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО И ЭНДОГЕННОГО ОКСИДА АЗОТА(Н) НА ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК У LACTOBACILLUS PLANTARUM
© 2013 г. Д. Р. Яруллина*,1, Л. В. Вакатова*, А. В. Криворучко**, Е. В. Рубцова**, О. Н. Ильинская*
*Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань **Пермский государственный национальный исследовательский университет Поступила в редакцию 10.12.2012 г.
Биопленки являются распространенной формой существования микроорганизмов в естественных условиях, и раскрытие механизма регуляции их образования имеет несомненное практическое значение для медицины и биотехнологии. В настоящей работе рассмотрено влияние оксида азота (NO) на формирование биопленок у Lactobacillus plantarum и установлено, что микромолярные концентрации экзогенного NO негативно влияют на этот процесс вследствие токсического действия на клетки. Однако снижение уровня эндогенного NO в бактериях под действием скавенджера оксида азота 2-(4-карбоксифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-3-оксида (cPTIO) ухудшало характеристики образующихся биопленок, что выражалось в уменьшении их размера.
Ключевые слова: оксид азота, лактобациллы, биопленки.
DOI: 10.7868/S0026365613040149
Бактерии рода Lactobacillus являются важной составляющей естественной микробиоты кишечника человека и массово используются в нормализующих микрофлору препаратах — пробиоти-ках. Механизмы пробиотической активности лактобацилл включают продукцию бактериоци-нов, молочной и уксусной кислоты [1]. Наряду с этими веществами, у ряда лактобацилл обнаружена способность синтезировать оксид азота (NO) [2, 3], который, вероятно, также выступает в качестве фактора пробиотической активности [4]. Необходимым условием для проявлениями лактоба-циллами их полезных свойств является колонизация ими кишечника посредством образования биопленок — скоплений колоний микроорганизмов, погруженных во внеклеточный матрикс и прикрепленных к поверхности [5]. Показано, что на формирование биопленок лактобациллами могут оказывать влияние желчь, муцины, кислотность, осмотическое давление, состав питательной среды [6], в частности, доступность источников углерода [5]. Выявлен также ряд генов, продукты которых участвуют в образовании биопленок у лактобацилл: wzb, dltD, luxS [5], mabA [7], ftsH [8], flm, сеpA [9]. Участие генов LuxS в формировании биопленок указывает на кворум-зависимую природу этого процесса у лактобацилл
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kasfes@gmail.com).
[5]. Кроме того, установлена корреляция между плотностью бактериальной культуры и образованием биопленок [6].
Недавно стало известно, что NO, связываясь с белком H-NOX (heme-nitric oxide/oxygen-binding) и изменяя концентрацию вторичного мессенджера циклического дигуанозин монофосфата (c-di-GMP), регулирует формирование биопленок у Legionella pneumophila, Shewanella woodyi, Shewanella oneidensis, Pseudoalteromonas atlantica [10—13]. Свойство оксида азота ингибировать образование биопленок у Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Candida albicans предложено использовать при терапии бактериальных и грибковых инфекций [14—16].
Настоящее исследование выполнено с целью выяснения роли оксида азота в образовании биопленок бактериями L. plantarum. Поскольку эти микроорганизмы способны самостоятельно синтезировать NO [2, 3], оценивали эффекты как экзогенного оксида азота, выделяющегося из нитропруссида натрия (SNP), так и эндогенного NO, синтезируемого бактериями по NO-син-тазному пути из L-аргинина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3, выделенные нами из препарата "Лактобактерин сухой" (ФГУП
418
ЯРУЛЛИНА и др.
100
^ 80
о 60
| 40 и
*
& 20
0
вМР, мМ 0.01 0.05 0.10 0.25 0.50 1.00 N0, мкМ 0.06 0.32 0.63 1.58 3.16 6.31
Рис. 1. Влияние экзогенного N0, выделяемого нит-ропруссидом натрия (SNP) на жизнеспособность Ь. р1аШагыт 8Р-А3. За 100% принята выживаемость клеток на среде без добавления SNP.
"Пермское НПО "Биомед") [3], и L. plantarum 52 из коллекции НИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (г. Санкт-Петербург). Бактерии выращивали при 37°С на среде MRS ("Merck"). В работе использовали субстрат NO-синтазы L-ар-гинин [17], донор NO нитропруссид натрия (SNP) [18] и скавенджер NO калиевую соль 2-(4-карбок-сифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-3-оксида (cPTIO) [19] ("Sigma-Aldrich"). Анализ влияния этих веществ на образование биопленок проводили в 96- луночных пластиковых планшетах (Cellstar Grenier bio-one No. 655180). В лунки вносили по 200 мкл культуры бактерий плотностью
3 х 107 КОЕ/мл в среде MRS, содержащей различные концентрации исследуемых веществ, и выращивали в течение 72 ч. Для оценки биопленок удаляли содержимое лунок, трехкратно промывали 1х PBS буфером, окрашивали 0.1% водным раствором генцианвиолета ("Sigma-Aldrich") (100 мкл/лунку) в течение 1 ч, снова промывали буфером, затем добавляли 96% этиловый спирт (100 мкл/лунку) и измеряли поглощение при длине волны 570 нм на микропланшетном ридере Tecan infinite 200 Pro (Швейцария). Интенсивность окрашивания раствора коррелирует с размером биопленок.
Концентрацию оксида азота в растворах SNP рассчитывали на основе содержания в них продуктов окисления NO — нитритов, которые обнаруживали спектрофотометрически с помощью реактива Грисса ("Sigma-Aldrich"). Для построения модельной калибровочной прямой использовали свежеприготовленные растворы NaNO2 ("Sigma-Aldrich") в концентрациях от 0 до 100 мкМ.
Чтобы определить влияние SNP на жизнеспособность бактерий, высевали лактобациллы на агаризованную среду MRS в присутствии различных концентраций вещества. О силе их токсического действия судили по выживаемости бактерий, выраженной в процентах от общего числа
колоний, выращенных на среде без добавок. Также для определения жизнеспособности бактерий окрашивали клетки реактивом LIVE/DEAD ^acLight Bacterial Viability Kit ("Molecular Probes"), следуя инструкциям фирмы-изготовителя. Данный реактив включает флуоресцентные красители SYTO 9 и йодид пропидия (PI) и флуоресцентно окрашивает жизнеспособные клетки в зеленый цвет, а клетки с поврежденными мембранами — в красный. С целью исследования биосинтеза NO лактобациллами, выращенные до стадии стационарного роста (48 ч) клетки осаждали центрифугированием, трижды отмывали от питательной среды буфером HBSS (1х Hanks' Balanced Salt Solution c солями кальция и магния, без фенолового красного, "PAA Laboratories GmbH", Австрия) и окрашивали в течение 1 ч флуоресцентным индикатором NO — 1,2-диаминоантрахинон сульфатом (DAA) ("Molecular Probes") в концентрации 50 мкг/мл, после чего трижды отмывали от красителя тем же буфером и готовили препараты [20]. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM 6000B (Германия). Для получения флуоресцентных изображений и измерения интенсивности флуоресценции использовали компьютерную программу Leica FW4000. Статистическую обработку результатов проводили в программе "Microsoft Excel". Для оценки достоверности различий использовали критерий Манна-Уитни; за критерий значимости отличий между двумя группами данных принимали критерий вероят-ностир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние экзогенного NO на биопленки. В последние годы на роль универсального регулятора образования биопленок у бактерий выдвигается оксид азота [10—13]. Для выяснения влияния экзогенного NO на биопленки лактобацилл в среду культивирования бактерий добавили SNP. Присутствие в пробах этого донора оксида азота привело к выделению NO и снижению жизнеспособности клеток пропорционально увеличению концентрации SNP (рис. 1). При добавлении в среду роста 1 мМ SNP в ней обнаруживается NO на уровне 6.3 мкМ, и регистрируется убыль жизнеспособности лактобацилл почти на 60% по сравнению с их ростом без SNP (рис. 1). При этом происходит ингибирование образования биопленок у обоих исследованных штаммов L. plantarum (рис. 2д).
Влияние эндогенного NO на биопленки. Поскольку ряд лактобацилл синтезирует оксид азота по NO-синтазному (NOS) пути [2, 3], мы исследовали возможность индукции синтеза оксида азота у L. plantarum 8Р-А3 и L. plantarum 52 субстратом NOS L-аргинином. Показано, что жизнеспособность лактобацилл не отличалась при росте с ами-
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО И ЭНДОГЕННОГО ОКСИДА АЗОТА(П)
419
%
120 100 80 60 40 20
0.1 мМ
ж
1 мМ
10 мМ 0.1 мМ
1 мМ 0.1 мМ
1 мМ
L-аргинин
SNP
cPTIO
Рис. 2. Влияние L-аргинина (а—в), нитропруссида натрия (SNP) (г, д) и скавенжера NO 2-(4-карбоксифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-3-оксида (cPTIO) (е, ж) на образование биопленок бактериями L. plantarum 8P-A3 (темные столбцы) и L. plantarum 52 (светлые столбцы). За 100% принято образование биопленок при росте на питательной среде MRS без добавок. * — достоверно отличается от 100%.
100 г
%
S #
о
80
60
40
20
(а)
2.5
(+) (-)
0.1 мМ L-аргинин
р
а
L
O 1.5
£
(+) 1.0
р
а
L- 0.5
O
N
0
(б)
L. plantarum 8P-A3 L. plantarum 52
Рис. 3. Влияние L-аргинина на жизнеспособность бактерий L. plantarum 8P-A3 (темные столбцы) и L. plantarum 52 (светлые столбцы), измеренную с помощью реактива LIVE/DEAD, (а) и биосинтез ими оксида азота, измеренный с помощью DAA (б). За 100% принято общее количество клеток в образце.
б
а
в
г
д
е
0
0
нокислотой и без нее (рис. 3а). В соответствии с "парадоксом L-аргинина", добавление экзогенного аргинина, независимо от его внутриклеточной концентрации, приводит к увеличению продукции NO [17]. Ранее мы продемонстрировали возможность определения NO в культуре бактерий с помощью флуоресцентного окрашивания DAA [20]. Внесение в среду роста 100 мкМ L-ар-гинина приводило к увеличению флуоресцентного сигнала клеток L. plantarum 8Р-А3 более чем в два раза по сравнению с клетками, инкубируемыми без аргинина, а бактерии L. plantarum 52 не активировали синтез NO в присутствии L-аргинина
(рис. 3б, 3в), что свидетельствует о штаммовых различиях в уровне активности NOS или скорости метаболизма L-аргинина как субстра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.