БИОФИЗИКА, 2014, том 59, вып. 2, с. 3Ó0-3Ó8
БИОФИЗИКА ОШОЖНЫХ CTСТЕМ ^
УДК 577.322
ВЛИЯНИЕ ФAKТOPА POCТA ФИБPOБЛACТOB FGF2 НА KAPДИOMИOЦИТAP НУЮ ДИФФEP ЕНЦИ P ОВКУ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ CТBOЛOBЫX КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ex vivo
© 2014 г. E.C. Лобанок, З.Б. Квачева, СВ. Пинчук, М.В. Волк, Л.М. Межевикина*, Е.Е. Фесенко*, И .Д. Волотовский
Гоcудаpcтвенное научноеучpежденuе Институт биофизики и клеточной uнженеpuu НАН Белаpуси,
220073, Минск, ул. А кадемическая 27, Белаpуcь Е-mail: volotovski@yahoo.com * Институт биофизики клетки РАН, 142290, ПущиноМосковской области Поступила в p едакцию 04.04.13 г.
Изучено влияние фактоpа pоcта фибpоблаcтов FGF2 на эффективность каpдиомиоцитаpной диффеpенциpовки мезенxимальныx стволовьи клеток костного мозга, индуц^ованной 5-аза-цитидином. Положительный эффект FGF2 появляется в увеличении тpанcкpипции генов Mef2A, Mef2D и Myh7B и pоcте концешрации в цитоплазме ионизованного Cа2+ ^и cоxpанении жизнеспособности клеток на высоком уpовне. Эффект pазвиваетcя к 14-м суткам после сочетанного действия диффеpенциpующего агента и p остового фактоpа. В p езультате внесения в cpеду pоcта клеток FGF2 появляется возможность обеспечить каpдиомиогенез и увеличить выгсод p анниx пpедшеcтвенников каpдиомиоцитов.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, 5-азацитидин, дuффеpенцupовка, фактоp pоcта фuбpоблаcтов, каpдuомuогенез.
Одним из способов клинического пр имене-ния клеточных технологий может стать использование мезенхимальных стволовых клеток (МСК), что обусловлено их способностью к дифференцир овке в различные клеточные типы и высокой пролиферативной активностью. В литературе появились сведения о том, что М С К используются при лечении ишемии миокарда, инфаркта миокарда, во время послеоперационного периода в кардиохирургии [1-4].
Первая попытка дифференцир овать М С К в клетки с кардиомиоцитарным фенотипом была осуществлена в 1999 г. Макино с сотрудниками [5], котор ый обр аботал иммортализованные мышиные МСК 5-азацитидином (5-аза). 5-аза представляет собой пр оизводное цитидина, встр аивающееся в ДНК и РНК. В составе ДНК 5-аза ингибирует метилирование нуклеиновых оснований, в результате чего «включается» транскрипция репрессированных генов [6,7], в
Cокpащения: МCR - мезенxимальные стволовые клетки, 5-аза - 5-азацитидин, FGF2 - фактоp pоcта фибpоблаcтов, FGFR - pецептоp FGF2, CМ-H2-DCF-DA - 5-(-6)-xлоp-метил-2',7'-диxлоpдигидpофлуоpеcцеиндиацетат, FITC -флуоpеcцеинизоционат, PE - фикоэpитpин.
частности генов таких кардиальных белков, как саркомерный миозин (MF20), десмин, карди-альный тропонин I, саркомерный а-актинин [8].
В настоящее вр емя большинство исследователей придерживается мнения, что «созревание» любых типов стволовых клеток, включая М СК, их коммитирование и дифференцировка зависят от интегрального действия факторов, формирующих индуцирующее микроокружение. Многие пр отоколы получения кар диомиоцит-подоб-ных клеток из МСК в условиях in vitro отличаются значительными вариациями и наряду с 5-аза включают целый ряд соединений - аскорбиновую кислоту, дексаметазон, диметил-сульфоксид, инсулин, ростовые факторы -TGFP1, PDGF, FGF2 [9,8]. Кроме того, кар-диомиоцитарная дифференцировка МСК может быть индуцирована в среде, содержащей ме-тилцеллюлозу, интерлейкины и фактор стволовых клеток [10].
Изучение дифференцир овки М С К под действием 5-аза [11,12] показало наличие у индуктора побочного цитотоксического эффекта и его способность вызывать дифференцировку клеток в других направлениях, например пре-
вращение в остеобласты или адипоциты [8]. Поскольку 5-аза подавляет пролиферативную активность клеток, возникает нежелательная ситуация - на фоне индукции кардиомиогенеза накопление клеточной биомассы в культуре заметно снижается. Поэтому при использовании 5-аза в качестве индуктора кардиомиоцитарной дифференцировки должен быть решен вопрос предотвращения нежелательных эффектов и поддержания высокой жизнеспособности клеток.
В связи с этим необходимо определить минимально эффективную концентрацию 5-аза, при котор ой определенные добавки в со став питательной среды обеспечили бы успешное деление клеток или повысили бы их жизнеспособность [13,14] без изменения направленности развития. В качестве таковой добавки был выбран фактор роста фибр областов РОР2, который участвует в кардиомиоцитарной дифферен-цировке мезодермальных клеток в процессе эмбрионального развития, поддерживает митоген-ные стимулы и увеличивает выживание многих типов клеток в культуре [15]. Розенблатт-Ве-лайн с соавторами [16] показали активацию экспрессии гена РОР2 в клетках миокарда взрослого организма при ишемии.
РОР2 - представитель семейства полипептидных факторов роста фибробластов, характеризующихся гомологией центрального коро-вого домена и высокой чувствительностью к гепарину [16]. Действие РОР2 на клетки осуществляется посредством его специфического связывания с трансмембранным белком-рецептором РвР2 (РвРИ) [15]. Связывание РвР2 с РОРИ сопровождается димеризацией рецепто -ра, стимулирует его тирозинкиназную активность, что приводит к аутофосфорилированию внутриклеточного домена и активизации молекул нисходящего сигнального пути [15].
Передача сигнала от РОРИ может осуществляться по трем главным сигнальным путям: МАП-киназному (И^/МАРК), фосфолипидно-му (РЬСу/Са2+), фосфоинозитол-киназному (Р13 кша8е/Ак!) [13,15].
Из литературных данных известно, что в процессах пр олифер ации клеток важную р оль играют активные формы кислорода, принимающие участие в клеточной сигнализации [17], а при образовании в избыточных количествах приводящие к деструкции клеточных компонентов и в конечном итоге к гибели клеток [18]. Активные формы кислорода также могут стимулировать процессы клеточной дифферен-цировки в МСК. Бугиш с сотрудниками [19] показали, что повышение концентрации активных форм кислор ода стимулирует эмбр иональ-ные стволовые клетки к кардиомиоцитарной
дифференцировке. Так, обработка эмбриоид-ных телец Н2О2 приводит к значительному усилению синтеза а-актинина, легкой цепи миозина (МЬС2а и МЬС2у), атриального (предсердного) натрийуретического пептида (АКР), транскрипционных факторов - миоцитарного энхансер-ного фактора 2с (МЕР2С), фактор а детерминации миокардиальных предшественников (Ккх2-5), мар кера прекардиальных клеток вАТА-4 и фактора роста ВМР-10 (костный морфогенетический белок), которые являются критическими при эмбриогенезе сердца [20]. Поэтому для р азработки подходов к кардиомиоцитарной диффер енцировке М СК при действии 5-аза важное значение приобретает оценка вклада активных форм кислорода и, в частности Н2О2, в ее реализацию.
В каждой дифференцированной клетке существует полный набор транспортных белков, ответственных за поддержание низкой концентрации цитоплазматического Са2+ [21]. Уже с самых р анних стадий онтогенетического развития синтетический аппарат клеток может про -изводить те белковые структуры, которые формируют кальциевые каналы в окончательно дифференцированных клетках. Однако экспрессия генов канальных белков может существенно меняться по ходу диффер енцировки. Ионы свободного Са2+, взаимодействуя с внутриклеточным мишенями, выступают в роли втор ичных медиаторов при индукции пролиферации и диф-ференцировки, а также в универсальном ответе клеток животного и растительного происхождения на стрессорные воздействия [22-25]. Чтобы выполнять р оль посредника, концентрация ионизированного Са2+ в цитоплазме должна поддер живаться на крайне низком (порядка 0,1 мкМ) уровне. Незначительное ее увеличение является сигналом, запускающим многие клеточные реакции [26-28]. В частности, кардио-миогенез сопровождается увеличением содержания в цитоплазме клеток свободных ионов С а2+ [29].
Согласно литературным данным, концентрация Н2О2 и Са2+ меняется на отдельных стадиях клеточного цикла при последовательном переходе клетки из состояния в состояния в1, Б, в2 и М [17,30-32]. В несинхронизи-рованной культуре интактных клеток внутриклеточное содержание Н 2О2 и Са2+ можно рассматривать в качестве индикатора пролифера-тивной активности клеточного пула.
В настоящей работе изучена кардиомиоци-тарная дифференцировка МСК, индуцируемая 5-аза в присутствии РОР2, с целью возможного использования данного ростового фактора для ослабления цитотоксического действия индук-
тора и увеличения накопления клеточной биомассы. Одновременно в процессе развития культур ы в клетках измеряли концентрации Н2О2 и Cа2+, что позволяло судить об уровне сигнальных пр оцессов в М СК и способности М C К к пролиферации на ранних этапах кардиомио-генеза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Источником мезенхимальных стволовых клеток служил костный мозг крыс 3-5-месячного возраста, содержавшихся в стандартных условиях вивария.
В работе использовали 5-азацитидин (Sigma, США), 2-меркаптоэтанол, L-глютамин (Sigma, США), смесь незаменимых аминокислот, витаминов, трипановый синий, рекомбинантный человеческий bFGF (Stem Cell ТесЬио1., Канада), HEPES (Calbiodiem, США), 5-(-6)-хлорметил-2',7'-дихлордигидрофлуор есцеин диацетат ^М -H2-DCF-DA) (Invitrogen, ОТА), F1uo3-AM (In-vitrogen, C ША), иономицин (Sigma, C ША). Для приготовления буферных и других растворов использовали соли и реактивы марки «хч» и «чда» фирм производства «Реахим» (Россия) и Sigma (ОТА).
Получение костного мозга и все манипуляции по выделению М C К проводили в стерильных условиях согласно методике, описанной в [33] с некоторыми модификациями. Cpазу после декапитации крысы из больших берцовых костей извлекали костномозговой стержень, помещали его в ср еду а-МЕМ (Invitrogen, CША) с антибиотиками пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) и гомогенизиро-вали. Полученную клеточную суспензию при плотности 2-106 кл/см2 высевали во флаконы (Sarstedt, Германия) с ростовой ср едой а-МЕМ со следующими добавками: 10% эмбриональной телячьей сывороткой (HyClone, Sigma, CША), 2 mM L-глутамином, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и культивир овали в течение 24 ч в CО2-инкубаторе (5% CО2, при 37°C). Затем ср еду с неадгезированным клеточным материалом удаляли, а адгезиро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.