ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2009, том 51, № 6, с. 962-971
УДК 541(49+64):547.963.32
ВЛИЯНИЕ ФАЗОВОГО СОСТОЯНИЯ ЛИПИДНОГО БИСЛОЯ НА СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА КОМПЛЕКСА ПОЛИКАТИОН-АНИОННАЯ ЛИПОСОМА1
© 2009 г. А. А. Ярославов, А. А. Ефимова, А. В. Сыбачин
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова. Химический факультет
119991 Москва, Ленинские горы
Исследовано взаимодействие катионного полимера поли-М-этил-4-винилпиридиний бромида с бислойными везикулами (липосомами), сформированными из смеси цвиттер-ионного дипальми-тоилфосфатидилхолина и анионного кардиолипина, с мольной долей отрицательно заряженных групп кардиолипина, равной 0.2. Показано, что состав и свойства комплекса поликатион-липосо-ма определяются фазовым состоянием липидной мембраны. Липосомы, мембрана которых находится в ЖК-состоянии ("жидкие" липосомы), сохраняют свою целостность в комплексе с поликатионом. Адсорбированный поликатион может быть полностью удален с липосомальной мембраны при добавлении избыточных количеств полианиона-конкурента. Адсорбция поликатиона на поверхности липосом, мембрана которых находится в состоянии геля ("твердые" липосомы), вызывает образование дефектов в мембране, что делает контакт поликатиона с такими липосомами необратимым. Образующиеся дефекты сохраняются и после перевода твердых липосом, на поверхности которых адсорбирован поликатион, в жидкое состояние. Более того, обратимый контакт поликатион-жидкие липосомы становится необратимым после перевода липосомальных мембран, связанных с поликатионом, в твердое состояние.
ВВЕДЕНИЕ
Физико-химические характеристики биологических (липидных) мембран во многом определяются фазовым состоянием липидного бислоя. Переход от гелевого (твердого) к ЖК-состоянию сопровождается уменьшением толщины бислоя [1-3], возрастанием скорости латеральной диффузии липидов и встроенных в мембрану белков [4-7], микрофазовым разделением в пределах бислоя [8, 9], повышением его проницаемости по отношению к низкомолекулярным веществам [10-12] и рядом других эффектов.
Твердые и жидкие липидные мембраны по-разному реагируют на адсорбцию синтетических макромолекул. Например, твердые анионные ли-посомы (сферические бислойные липидные везикулы) необратимо связывают катионные макромолекулы [13]. При этом в липосомальной мембране формируются дефекты, через которые происходит вытекание водорастворимого вещества (флуорофора или низкомолекулярной соли) из внутреннего объема липосомы в окружающий раствор [13, 14]. Напротив, контакт жидких ани-
1Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 06-03-32907-а).
E-mail: ephimova@genebee.msu.su (Ефимова Анна Александровна).
онных липосом с поликатионом полностью обратим: поликатион может быть вытеснен с поверхности липосом добавлением низкомолекулярной соли или избытка анионного полимера-конкурента [15, 16]. Целостность липосомальной мембраны при таком контакте сохраняется [13, 17].
В настоящей работе проанализировано поведение комплекса поликатион—анионная липосо-ма при изменении фазового состояния липидного бислоя. Существенное отличие от цитированных выше работ состояло в том, что переход от твердого состояния к жидкому (и в обратном направлении) инициировался не в исходных липо-сомах, а в уже сформированном комплексе. В практическом плане полученная информация представляет интерес для разработки подходов к получению полимер--липидных нанокапсул для контролируемого высвобождения биологически активных веществ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Дифосфатидилглицерин (кардиолипин, КЛ2-), раствор в этаноле концентрации 5 мг/мл; дипальми-тоилфосфатидилхолин (ДПФХ); дипальмитоилфос-фатидилэтаноламин, меченный флуоресцеинизо-тиоцианатом (ДПФЭ-ФИТЦ) производства "Sigma", использовали без дополнительной очистки.
Малые моноламелярные смешанные липосо-мы ДПФХ/КЛ2- получали методом озвучивания. Навеску ДПФХ растворяли в этаноле, смешивали с необходимым количеством этанольного раствора КЛ2- и тщательно удаляли органический растворитель на вакуумном роторном испарителе "Rotavapor" ("Buchi") при 55°С. Образовавшуюся тонкую пленку липидов диспергировали в 2 мл 10-2 М боратного буфера, рН 9.2. После этого на препарат воздействовали ультразвуком c частотой 22 кГц в течение 400 с (2 х 200 с) в непрерывном режиме при постоянном нагревании водой до 55°С. Использовали ультразвуковой диспергатор 4710 ("Cole-Parmer"). Полученные липосомы отделяли от титановой пыли на центрифуге J-11 ("Beckman") в течение 5 мин при скорости 12 х 103 об/мин. Таким образом были приготовлены липосомы ДПФХ/КЛ2- с мольной долей отрицательно заряженных "головок" КЛ2- v = = 2[КЛ2-]/([ДПФХ] + 2[КЛ2-]) = 0.2 (каждая молекула КЛ2- несет по две анионные группы).
Липосомы со встроенной в бислой флуоресцентной меткой получали добавлением к смеси растворов липидов 0.2 мг ДПФЭ-ФИТЦ (1% от общей массы липидов). Липосомы с заключенным во внутренний объем хлоридом натрия готовили, диспергируя липидную пленку в 10-3 М бо-ратном буфере, дополнительно содержавшем 1 моль/л NaCl. Полученную суспензию диализо-вали в течение 4.5 ч против 10-3 М боратного буфера, который меняли каждые 1.5 ч.
Суммарная концентрация липидов в образцах составляла 10 мг/мл, при этом мольная концентрация КЛ2- была равна 2.8 х 10-3 моль/л. Если не оговорено особо, в экспериментах концентрация липидов составляла 1 мг/мл (2.8 х 10-4 моль/л).
Размер липосом, определенный методом квазиупругого светорассеяния, варьировали в пределах 40-50 нм.
Поли-^этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭП) получали исчерпывающим алкилировани-ем поли-4-винилпиридина бромистым этилом [18] (фракция поли-4-винилпиридина со степенью полимеризации 600). Согласно данным ИК-спектро-скопии, степень алкилирования полимера составляла 92-95%. Таким образом, каждая цепь ПЭП включала ~560 катионных звеньев. В работе использовали полиакриловую кислоту (ПАК) со степенью полимеризации 350 ("Aldrich").
Комплексы липосом с ПЭП готовили следующим образом. К 10-3 М боратному буферному раствору с pH 9.2 последовательно добавляли 100 мкл 10 мг/мл суспензии липосом и соответствующий объем 10-3 М раствора ПЭП. Полученный образец, общий объем которого был равен 1 мл при всех соотношениях липид : ПЭП, перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 мин
при температуре 20 или 55°С, после чего проводили необходимые измерения.
Воду очищали двойной перегонкой с последующим пропусканием через систему Milli-Q ("Миллипор"), включающую ионообменные, адсорбционные колонки для глубокой очистки от органических примесей и фильтры для удаления крупных частиц. Очищенная таким образом вода имела удельную электропроводность 0.56 мкСм/см.
Методы
Размер частиц определяли методом квазиупругого светорассеяния на приборе "Autosizer IIc" ("Malvern"), электрофоретическую подвижность (ЭФП) — методом лазерного микроэлектрофореза на приборе "Zetasizer IIc" ("Malvern"). В обоих случаях источником света служил гелий-неоновый лазер с длиной волны падающего света 633 нм. Автокорреляционную функцию флуктуации интенсивности рассеяния света получали с помощью коррелятора К7032-09 ("Malvern").
Интенсивность флуоресценции растворов измеряли на спектрофлуориметре F-4000 ("Hitachi"). Концентрацию ПЭП в растворе определяли на спектрофотометре S-3000 ("Hitachi") по характеристической полосе поглощения кватернизо-ванного пиридинового кольца при X = 257 нм, принимая мольный коэффициент экстинкции равным 3350 л/моль см.
Значения pH растворов оценивали с помощью рН-метра рНМ 83 ("Radiometer"). В качестве измерительного электрода использовали стеклянный электрод Р1041, в качестве электрода сравнения — каломельный электрод К4041. Проводимость растворов определяли на кондуктометре CDM 83 ("Radiometer") с платиновым электродом PP1042.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Целью настоящей работы было получение ответа на вопрос: влияет ли (и если да, то каким образом) изменение фазового состояния липо-сомальной мембраны на свойства уже сформированного комплекса поликатион—липосома. Однако прежде чем обратиться к анализу поведения такой системы, мы исследовали по отдельности связывание поликатиона с твердыми и жидкими анионными липосомами. Это позволило описать два предельных случая, которые, как можно надеяться, будут определять границы эффектов, развивающихся при обращении фаз липидного бис-лоя в комплексе поликатион—липосома.
Связывание поликатиона с твердыми и жидкими липосомами
Ранее методом ДСК было показано, что мембрана смешанных липосом ДПФХ/КЛ2- (v = 0.2) характеризуется широким фазовым переходом с
[ПЭП] х 104, моль/л
Рис. 1. Зависимость ЭФП частиц в системе ПЭП—липосомы от концентрации ПЭП до (1, 2) и после (3, 4) добавления ПАК при 20 (1, 3) и 55°С (2, 4). [ПАК] : [ПЭП] = 3 : 1. Липосомы ДПФХ/КЛ2-, V = 0.2. Здесь и на рис. 2-8 концентрация липосом 1 мг/мл, [КЛ-2] = 2.8 х 10 4 моль/л, 10 2 М боратный буфер; рН 9.2.
максимумом при Т1 = 33.2 и плечом при Т2= 37.1 °С [19]. Ниже температуры Т1 липидный бислой находится в состоянии геля с резко ограниченной подвижностью липидных молекул ("твердые" липосомы). При температуре выше Т2 мембрана переходит в ЖК-состояние, и подвижность липидов в ней значительно возрастает ("жидкие" липосомы). Таким образом, переход липидного бислоя из состояния геля в состояние жидкого кристалла и в обратном направлении может быть реализован путем изменения температуры липосомальной суспензии. В нашей работе твердые липосомы ДПФХ/КЛ2- (V = 0.2) получали охлаждением суспензии до 20°С, жидкие — ее нагреванием до 55°С.
Для регистрации взаимодействия ПЭП с липо-сомами был использован метод микроэлектрофореза. Подход основан на том, что адсорбция поликатиона на поверхности смешанных анионных липосом сопровождается нейтрализацией их поверхностного заряда, что отражается на величине ЭФП липосом. На рис. 1 приведены зависимости ЭФП для твердых и жидких липосом ДПФХ/КЛ2- от концентрации добавленного ПЭП. В обоих случаях добавление ПЭП вначале приводило к уменьшению ЭФП липосом до нуля, затем происходила перезарядка поверхности и, н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.