ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 6, с. 688-692
УДК 577.152.32:579.852.11
ВЛИЯНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ НА ПРОЦЕСС ОБРАЗОВАНИЯ ГЕЛЕЙ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА
© 2004 г. А. В. Ильина, В. П. Варламов
Центр "Биоинженерия" РАН, 117312 Москва; e-mail: varlamov@biengi.ac.ru Поступила в редакцию 05.02.2004 г.
Показана возможность образования физических гелей на основе пчелиного хитозана - пчелозана (230 кДа, степень ацетилирования, СА 26-65%). Подобраны условия получения гелей (1%-ный раствор в 1%-ной гликолевой кислоте; 25°С; рН 5.5-7.5). Изучено влияние концентрации исходного раствора, СА пчелозана, величины рН на процесс гелеобразования. Полученные гели можно отнести к токсотропно-обратимым системам, они устойчивы в интервале температур от 18 до 55°С, стабильны в течение длительного времени. Для геля с СА 34% было характерно явление необратимого синерезиса.
Гели, получаемые на основе природных полисахаридов, нашли широкое применение в косметической, фармацевтичской отраслях, пищевой промышленности. Особый интерес вызывают физические гели, которые в отличие от химических (ковалентно сшитых) сохраняют основные свойства природного полисахарида, в частности биосовместимость [1].
Полиаминосахарид хитин и его производное хитозан как и большинство высокомолекулярных природных соединений относятся к амфифиль-ным полимерам. Следствием этого является образование физических гелей при определенных условиях [2, 3]. Застудневание (гелеобразование) это процесс фазового перехода из жидкого в твердое состояние. Образование студня (геля) происходит в результате взаимодействия между макромолекулами высокомолекулярного соединения (ВМС). Макромолекулы хитозана неоднородны и имеют гидрофильные и гидрофобные участки. У гидрофильных групп макромолекул (-NH2, -ОН) образуются гидратные слои. Эти слои экранируют отдельные участки макромолекул. Гидрофобные группы, например -СН2-, неспособны формировать подобные слои. Наличие свободных, не защищенных гидратной оболочкой участков макромолекул при определенных условиях, в частности при росте концентрации ВМС, приводит к возникновению взаимодействия между этими участками; в результате образуется структура, т.е. каркас (сетка) из макромолекул и раствор ВМС переходит в студень. На застудневание требуется определенное время, которое зависит от температуры, природы и концентрации ВМС и может колебаться от нескольких минут до недель.
Цель работы - изучение влияния физико-химических параметров на процесс образования гелей из хитозана и исследование некоторых их свойств.
МЕТОДИКА
В работе использовали пчелиный хитозан -пчелозан, производимый ЗАО "Биопрогресс", Россия как описано в работе [4]. Для удобства проведения экспериментов полученный пчелозан частично деполимеризовали ферментным препаратом Целловиридин Г20х согласно методике, ранее нами предложенной [5], в данном эксперименте продолжительность гидролиза составляла 10 мин.
Дополнительная очистка пчелозан. 1 г растворили в 50 мл 1М раствора уксусной кислоты при перемешивании в течение 30 мин. Полученный раствор отфильтровали от механических примесей и подтитровали 2 М раствором КаОН до рН 8.5-9.0. Образовавшийся осадок отделили фильтрованием, промыли водой до рН 7.0, спиртом и далее инклюдировали последним в течение 18 часов, после чего его отфильтровали и высушили на воздухе при комнатной температуре до постоянного веса (выход составил 70%). Дополнительно очищенный пчелозан имел степень ацетилирования (СА) 17%, характеристическую вязкость 5 дл/г и средневязкостную молекулярную массу (М.м.) 230 кДа.
Реацетилирование исходного пчелозана. Реакцию проводили в вводно-спиртовой среде (2%-ная уксусная кислота-метиловый спирт в соотношении 1 : 1.25 на 1 г пчелозана). Ацетилирующий реагент добавляли в количестве 2.5-5.0 ммоль. При выборе соотношения растворителей, уксусного ангидрида и хитозана руководствовались литературными данными [6, 7]. Время реакции составля-
ло 5 мин при 22°С. Диализ проводили в течение 24 ч с 3-кратной сменой воды и перемешивании. Выход лиофильно-высушенного пчелозана составлял 90%.
Определение степени ацетилирования пчелозана. Использовали метод кондуктометрического титрования [8]. Навеску (200 мг) образца пчелозана со свободными аминогруппами суспендировали в 20 мл 0.1 М НС1 и 80 мл дистиллированной воды и перемешивали в течение 30 мин. Полученный раствор титровали 0.5 М КаОН, добавляя его порциями по 0.1 мл через каждые 30 сек при перемешивании. Количество щелочи, необходимое для титрования свободных аминогрупп, определяли из построенного графика. Степень дезаце-тилирования (СД) рассчитывали по формуле: СД = 203К/Р + (42Ш), где V - разница объемов КаОН, полученная в результате пересечения прямых на графике; N - нормальность щелочи; Р -навеска хитозана. Величину СА рассчитывали по формуле: СА = 100 - СД.
Получение гелей на основе пчелозана. Образец пчелозана (10 мг/мл) растворяли при перемешивании в 1%-ной гликолевой кислоте при 25°С. Полученный раствор (рН 3.0) подтитровывали триэтаноламином (2-200 мкл) при интенсивном перемешивании до рН 5.5-7.5, при котором наблюдали образование геля.
Определение динамической вязкости гелей.
Измерения проводили на ротационном вискозиметре Брукфильда с цилиндрическим ротором. Для этого первоначально готовили 1%-ный образец пчелозана в 1%-ной гликолевой кислоте (рН 3.0), далее после каждого подтитровывания триэтаноламином замеряли вязкость.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Химическая структура пчелозана характеризуется наличием ряда функциональных групп, способствующих балансу гидрофильных и гидрофобных взаимодействий и приводящих к гелеоб-разованию. Для достижения критической точки (момент образования физического геля) необходимо создать условия, затрудняющие движение полимерных цепей в растворе. В качестве растворителя использовали 2-гидроксиэтановую (гли-колевая) кислоту, которая по сравнению с этано-вой (уксусная) улучшала процесс гелеобразова-ния благодаря наличию гидроксильной группы, которая способствовала образованию дополнительных водородных связей, уменьшающих подвижность молекул пчелозана. Считают, что концентрация полимера до желирования должна быть близка к критической концентрации (С*). Например, для крабового хитозана (М.м. 190 кДа, СД 0.88) это значение составляло 1 мг/мл [9]. Учитывая, что при такой концентрации раствор пчелозана ха-
рактеризовался очень низкой вязкостью (10 сР), не способствующей гелеобразованию, мы начали свои исследования с растворов, имеющих большую концентрацию 5, 10, 15 и 20 мг/мл и соответственно вязкость 44, 134, 409 и 2700 сР . Как оказалось, при 5 мг/мл гелеобразование отсутствовало, но уже при 10 мг/мл наблюдалось образование устойчивых гелей. При дальнейшем увеличении концентрации гели также образовывались, но проведение экспериментов было затруднено, ввиду высокой вязкости исходных растворов (27003500 сР).
Следующий параметр, влияющий на процесс гелеобразования, плотность заряда полимера, которая, в первую очередь, определяется величиной СА пчелозана и степенью ионизации, которая зависит от рН раствора. О влиянии химической модификации на процесс гелеобразования хитозана сообщалось ранее [10-12], и самая простая состояла в варьировании СА путем реацетилирования хитозана, изначально имеющего низкую СА (15%). Увеличение СА образцов приводило к изменению вязкости раствора пчелозана. По мере ее возрастания в интервале от 17 до 45% вязкость уменьшалась от 154 до 121 сР, но при дальнейшем увеличении от 47 до 65% увеличивалась от 235 до 304 сР в условиях проведения эксперимента (рН 3.0; 1%-ный раствор образца в 1%-ной гликолевой кислоте). Нарастание вязкости растворов полимера при СА более 47%, вероятно, можно объяснить с точки зрения процесса набухания. При растворении пчелозана с СА 17-45% происходит диффузия молекул растворителя в макромолекулы ВМС. Вследствие сольватации и отталкивания одноименных зарядов сольватных слоев рвутся слабые связи между звеньями макромолекул, что приводит к разрыву слабых связей между макромолекулами. Далее происходит диффузия самих макромолекул в раствор (неограниченное набухание). Для образцов с СА более 47% количество положительно заряженных в кислой среде аминогрупп снижается, поэтому сольватация растворителем слабее, кроме этого усиливается тенденция к образованию водородных связей между ОН-группами в шестом положении гексозных звеньев с карбонилом в ацетамидных группах соседних звеньев, что также препятствует разрыву связей между макромолекулами (имело место ограниченное набухание).
Величина рН раствора оказывала непосредственное влияние на процесс гелеобразования (табл. 1). Первоначально при возрастании рН от 3.0 до 4.2 вязкость снижалась, приблизительно на 20-30%, (кроме образца со СА 65%, для него она сразу возрастала ). Далее при изменении рН от 5.0 до 6.2 увеличивалась на 20-58% (образцы с СА 26-34%). Для пчелозана со СА 17% при рН 5.56.2, несмотря на увеличение вязкости на 20-30%, гелеобразование отсутствовало, а имело место
Таблица 1. Влияние величины рН на вязкость 1%-ного раствора пчелозана
СА, %
Динамическая вязкость*, сР
рН
3.0 3.6 4.2 5.0 5.5 6.2 6.6 7.0 7.5
17 154 117 103 100 125 179 - - -
26 146 111 109 133 197 317 1500 - -
28 135 102 97 108 184 383 1800 - -
34 129 102 98 122 180 202 329 543 1500
45 121 88 80 75 82 97 141 222 1200
47 235 198 193 257 478 3000 - - -
65 304 325 355 533 2000 - - - -
* Измерение динамической вязкости проводили при 25 ± 0.5°С, в 1%-ной гликолевой кислоте. Прочерк в таблицах - определение не проводили.
Таблица 2. Влияние температуры на динамическую вязкость 1%-ных гелей пчелозана
Динамическая вязкость, сР
СА, % рН Температура, °С
18 25 30 37 45 55
26 6.2 430 317 232 206 142 120
0 26* 46 52 67 72
28 6.2 480 383 283 254 202 144
0 20 41 47 58 70
34 7.0 680 543 450 408 272 190
0 20 36 40 60 72
45 7.0 282 222 182 172 103 70
0 21 35 39 63 75
47 5.0 319 257 185 159 116 85
0 19 42 50 64 73
65 4.2 450 355 249 234 158 125
0 21 45 48 65 72
* Снижение динамической вязкости, %.
снижение растворимости, пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.