РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013, том 7(16), № 1, с. 63-69
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ВЛИЯНИЕ ФЛАВОНОИДОВ НА АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТОРЫ РЕАКЦИИ КОНТАКТНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
© 2013 г. С.И. Павлова**/***, Д.З. Албегова*, А.А. Кягова*, М.Д. Цицуашвили*, И.Г. Козлов*/**
*ГБОУ ВПОРоссийский национальный исследовательский медицинский университет
им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия;
***ФГБУ ФНКЦДетской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва, Россия;
***ФГБОУ ВПО Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары, Россия
Поступила: 04.02.2013. Принята: 18.02.2013
Одним из экспериментальных методов оценки действия различных агентов на антиген-специфические эффекторы контактной чувствительности (КЧ) являются опыты по их адоптивному переносу сингенным животным. В данной работе был использован этот подход для изучения прямого влияния флавоноидов корня солодки (ФКС) на спленоциты мышей, а также на Т-лимфоциты и их субпопуляции, выделенные из суспензии спленоцитов с помощью иммуномагнитной сепарации.
Ключевые слова: флавоноиды, контактная чувствительность, адоптивный перенос
ВВЕДЕНИЕ
Флавоноиды — группа полифенольных соединений, присутствующих практически во всех высших растениях. Опираясь на результаты многочисленных современных исследований, можно утверждать, что эти природные соединения обладают широким диапазоном биологических активностей, проявляя противовоспалительные, иммунотропные, антиканцерогенные, противоопухолевые и многие другие свойства [1, 2]. При этом описанные эффекты могут реализовываться благодаря тому, что флавоноиды (изофлавоны, халконы) влияют на фосфорилирование ключевых молекул сигнальных путей в клетках, ингибируя активность протеинтирознкиназ [3]. На этом основании мы предположили, что флавонои-ды могут стать новым источником для изыскания лекарственных препаратов с иммуно-супрессивной активностью.
В нашей лаборатории были проведены исследования с использованием модели кон-
Адрес: 117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1, РНИМУ, кафедра фармакологии РНИМУ. E-mail: rgmu2008@yandex.ru
тактной чувствительности (КЧ), индуцированной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ) у мышей, где флавоноиды корня солодки (ФКС) эффективно подавляли развитие реакции КЧ. Ингибирование КЧ зависело от пути введения ФКС лабораторному животному и максимально проявлялось при внутривенном введении исследуемого агента. В дальнейшем в этой же модели были предприняты попытки выяснения механизмов действия ФКС. Выявлено, что угнетение КЧ при введении ФКС на начальных этапах фазы сенсибилизации может быть следствием блокирования пролиферации Т-лимфоцитов-эффекторов КЧ, а также «переключения» иммунного ответа [4]. С учетом многоэтапности реализации патогенеза реакции КЧ очевидно, что механизмы ограничения развития данной реакции под действием тех или иных иммуносупрессив-ных агентов могут быть многообразны. Так, оставался открытым вопрос о возможном прямом супрессорном влиянии ФКС на зрелые клетки-эффекторы КЧ.
Целью данной работы являлось исследование возможного влияния ФКС на функциональную активность зрелых иммуно-компетентных клеток и их субпопуляций,
участвующих в реализации КЧ. Для реализации поставленной цели был использован метод адоптивного переноса, в основе которого лежит индукция КЧ при введении несенсиби-лизированному животному зрелых Т-лимфо-цитов-эффекторов от сенсибилизированного сингенного донора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препарат флавоноидов
Флавоноиды выделяли из сухого коммерческого экстракта корней солодки (ООО «Хармс», С.-Петербург) методом спиртовой экстракции с последующей очисткой с применением адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Polyamide 6; Fluka, Германия). Полифенольный состав выделенного препарата ФКС доказывали проведением анализа спектров поглощения в ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах длин волн. Препарат ФКС стандартизировали фотометрическим методом Fo-lin-Ciolalteu, используя в качестве стандарта галловую кислоту (Acros Organics, Германия) [5]. Дополнительно проводилась биологическая стандартизация каждой серии выделенного препарата с использованием опухолевой линии U-937. В экспериментах использовали препарат ФКС, который в концентрации 10 мкг/мл (в пересчете на галловую кислоту) ингибировал пролиферацию опухолевых клеток линии U-937 до уровня 44,0±2,4% от контрольного значения.
В клеточную суспению вносили раствор ФКС в этаноле (рабочая концентрация 20 мкг/мл) так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В качестве контроля использовали соответствующие объемы растворителя. Во всех экспериментах после 30-минутной инкубации (37 °C, 5% CO2) с препаратом клетки отмывали от тестируемого агента и медленно вводили внутривенно мышам в объеме 0,5 мл раствора Хенкса с 10 mM HEPES-буфера.
Лабораторные животные
В экспериментах были использованы мыши линии СВА (H-2k) (самцы весом 18 — 20 г., возраст 8-10 недель), полученные из питомника РАМН (Крюково, Московская область). Животные содержались на стан-
дартном пищевом рационе вивария при свободном доступе к воде и пище.
Модель КЧ
Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно общепринятому экспериментальному подходу с незначительными модификациями [6]. Животных сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне на 0 день. Через 6 суток после сенсибилизации на внутреннюю поверхность правого уха наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2% ДНФБ). На левое ухо наносили 5 мкл растворителя (ацетона). Отрицательным контролем (К-) служила группа интакт-ных (несенсибилизированных) мышей, получивших только аппликацию разрешающей дозы ДНФБ. Через 24 часа после повторного нанесения ДНФБ оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека правого и левого ушей (специфическое локальное воспаление). Толщину ушей измеряли в миллиметрах специальным микрометром, снабженным световым сигналом (Россия).
Адоптивный перенос КЧ
У сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров через 6 суток после сенсибилизации выделяли клетки селезенки. Суспензию спленоцитов (3*107 кл/мышь, 0,5 мл) или их отдельные популяции (CD3 + , CD4+, CD8 + ), веделенные из того же количества клеток селезенки, медленно внутривенно вводили в хвостовую вену интактным мышам-реципиентам. В опытной группе клетки инкубировали с ФКС в течение 30 мин. при 37°C и 5% CO2, в контрольной — с соответствующим объемом растворителя. Через 1 час после переноса клеточной суспензии мышам-реципиентам, включая интактных мышей (К-, отрицательный контроль), наносили разрешающую дозу ДНФБ на внутреннюю поверхность уха. На внутреннюю поверхность другого уха в качестве контроля наносили такой же объем ацетона. Еще через 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов вышеописанным методом.
Иммуномагнитная сепарация
Для получения отдельных популяций спле-ноцитов использовали метод негативной селекции и набор реактивов Dynal Mouse
Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Фракции клеток, не относящихся к интересующей популяции, удаляли, обрабатывая спленоциты коктейлем монокло-нальных антител (IgG высокоспецифичные к поверхностным популяционным маркерам) и связывающими их парамагнитными полимерными микрочастицами Dynalbeads. Сепарацию проводили в магнитном поле штатива DynalMag-2 (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Очищенную популяцию, не прикрепившуюся к полимерным микрочастицам (в составе супернатанта), отмывали и после подсчета использовали для обработки ФКС in vitro, а затем вводили внутривенно экспериментальным животным.
Контроль чистоты популяции осуществляли методом проточной цитометрии на ци-тофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman-Coulter, США) с использованием флюоро-хром-меченых моноклональных антител к CD3, CD4, CD8 антигенам мышей (Invitrogen, США).
Оценка жизнеспособности и «раннего» апоптоза
Количественные исследования жизнеспособности и апоптоза клеток при воздействии изучаемого агента проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, США). Для анализа использовали аликвоты, содержащие 106 клеток.
Статистическая обработка
Результаты обрабатывали методами вариационной статистики, рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку среднего значения. Достоверность различий между опытными и контрольными группами в экспериментах определяли по критерию Стьюдента с использованием пакета анализа данных программы Excel для Windows XP. Различия считались достоверными при р < 0,05, где р — уровень значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нами был использован метод адоптивного переноса реакции контактной чувствительности сингенным животным для изучения прямого влияния ФКС на спленоциты мышей, а акже на T-лимфоциты и их субпопуля-
ции, выделенные из суспензии спленоцитов с помощью иммуномагнитной сепарации.
Результаты экспериментов по адоптивному переносу КЧ спленоцитами сенсибилизированных мышей-доноров интактным мышам-реципиентам представлены на рис. 1.
Как демонстрирует гистограмма, в группе К- аппликация разрешающей дозы ДНФБ не вызывала развития реакции КЧ: разница толщины ушей составляла 0,010 ± 0,004 мм. Напротив, перенос спленоцитов от сенсибилизированных ДНФБ доноров интактным мышам-реципиентам приводил к сенсибилизации, что проявлялось в развитии у последних КЧ уже при первичной аппликации ДНФБ на ухо. У мышей данной группы отек составил 0,099 ± 0,008 мм, что было сравнимо с интенсивностью КЧ в группе положительного контроля (K + ) без адоптивного переноса. Однако в том случае, когда спленоциты предварительно (до введения мышам-реципиентам) инкубировали в течение 30 мин. с ФКС, адоптивный перенос КЧ не наблюдался. Отек уха в этой группе мышей составлял в среднем 0,016 ± 0,006 мм, что достоверно не различалось с таковыми значениями в группе отрицательного контроля, и было на 84 % (p < 0,05) ниже в сравнении с группой K-/+ (адоптивный перенос КЧ спленоцитами).
Для оценки апоптогенного эффекта ФКС, спленоциты инкубировали 0,5; 2; 6; 12 ч в его присутствии, затем окрашивали аннексин-ФИТЦ и пропиди
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.