ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.262
ВЛИЯНИЕ ФЛАВОНОИДОВ НА СОСТАВ ГЛИКОПОЛИМЕРОВ ПОВЕРХНОСТИ AZOSPIRILLUM ЫРОГЕЯиИ Sp59b
© 2014 г. М. В. Каневский*, **, С. А. Коннова*, **, А. С. Бойко**, Ю. П. Федоненко**, Е. Н. Сигида**, В. В. Игнатов*, **
*Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского **Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов Поступила в редакцию 13.08.2013 г.
Выращивание культуры типового штамма Azospirillum Иро/вгит $р59Ь в присутствии флавоноида кверцетина индуцирует изменение структуры липополисахарида бактерий. Показано, что при культивировании микроорганизмов в присутствии флавоноида происходит изменение серологических свойств азоспирилл, увеличение гетерогенности пула молекул липополисахарида внешней мембраны, изменение состава и соотношения жирных кислот в липиде А. Установлено, что флавоноид индуцирует синтез О-специфического полисахарида, повторяющееся звено которого представлено тетрасахаридом, состоящим из линейного трисахаридного фрагмента из остатков а-Ь-КЬар в основной цепи и терминального остатка Р-В-01ср. Структура этого О-специфического полисахарида идентична установленной ранее структуре капсульного ПС этих бактерий, выращенных без кверце-тина. Выявлены изменения в составе капсульного полисахарида, индуцированные выращиванием в присутствии кверцетина.
Ключевые слова: Azospirillum lipoferum, липополисахарид, флавоноиды, кверцетин, капсульные полисахариды бактерий.
DOI: 10.7868/S0026365614020116
Известно, что флавоноиды растений играют заметную роль в микробно-растительных взаимодействиях в ризосфере. Показано, что обогащенные флавоноидами экссудаты активируют экспрессию ризобиальных генов, вовлеченных в установление бобово-ризобиального симбиоза [1,2]. Флавоноиды играют важную роль в индукции гена GmGin1 грибов при образовании арбус-кулярно-микоризальных симбиозов; вызывают экспрессию vir-гена у фитопатогенов рода Agro-bacterium [3]; выделяются из корней растений как хемоаттрактанты и ускорители роста многих бактериальных культур [4]. Для бактерий рода Si-norhizobium установлено, что влияние флавонои-дов на формирование симбиотических отношений реализуется с участием гликополимеров поверхности бактерий, у которых происходит инициированное флавоноидами изменение состава углеводных компонентов поверхности, а именно экзополисахаридов (ЭПС), капсульных (КПС) и липополисахаридов (ЛПС) [5]. Показано участие флавоноидов в регуляции активности генов, вовлеченных в синтез ЭПС и ЛПС у эндо-фитных симбионтов растений — бактерий рода Herbaspirillum [6]. В недавнем прошлом опублико-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: konnovasa@yandex.ru).
ваны данные об индуцировании флавоноидами модификации О-специфических полисахаридов (ОПС) у ассоциативных симбионтов псевдомонад [7], а также о влиянии экссудатов пшеницы на электрофоретический профиль ЛПС азоспи-рилл [8]. Однако влияние флавоновых веществ на состав углеводных компонентов клеточной мембраны ассоциативных микроорганизмов, типичным представителем которых являются бактерии рода Azospirillum, не изучено. Учитывая, что КПС и ЛПС участвуют во взаимодействии азоспирилл с растениями [9, 10], решение данного вопроса является важным для понимания роли их метаболитов в формировании растительно-микробных ассоциаций.
Выбор штамма с А. Нро/вгит 8р59Ъ связан с тем, что ранее у исследуемой культуры показано наличие достаточно редких для азоспирилл антигенных и структурных отличий мембранных ПС (из ЛПС) от капсульных ПС (из липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК)) при выращивании на селективной минеральной среде с малатом натрия. Более того, нами ранее были установлены [11, 12] для О-специфического (I) и капсульного (II) полисахаридов структуры повторяющихся звеньев, которые приведены ниже:
143
2*
a-L - Rhap - (1 —- 3) - a - L-Rhap-(1 — 2) - a-L-Rhap - (1 — 3) - p - D - Manp
1
I
4
—>-3)-p-D-Galp-(1 —»- 3)-a-D-Galp-(1^ (I)
OAc ~60—65% 2
3)-a-L-Rhap-(1—- (II)
P-D-Clcp 1
I
3
-2)-a-L-Rhap-(1 — 3)-a-L-Rhap(1-
Эта особенность бактерий дает возможность наблюдения изменений в составе двух типов полисахаридов — ЛПС и КПС под воздействием вторичных метаболитов растений. При выборе модельной пары бактерия—метаболит растения исходили из того, что в составе вторичных метаболитов фенольной природы в почве присутствуют различные флавоноиды, в том числе флавонол кверцетин [13—15]. Кверцетин является широко распространенным представителем и исходным веществом для синтеза многих флавонолов, наиболее изученным с точки зрения физиологической активности по отношению к различным организмам [16]. Кроме того, на начальном этапе исследований в сравнительном эксперименте использовали для анализа более гидрофобный по сравнению с кверцетином вторичный метаболит растений — нарингенин, и более гидрофильный — рутин.
Цель работы состояла в выявлении в модельном эксперименте возможного влияния флаво-ноидов на структурные особенности липидных и углеводных компонентов гликополимеров поверхности бактерий А. Нро/втт 8р59Ъ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Типовой штамм А. Нро/втт 8р59Ъ (АТСС 29707) [17], изолированный с корней пшеницы, любезно предоставлен коллекцией микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов). Культуру А. Н-ро/вгит 8р59Ъ выращивали в жидкой синтетической малатной среде [18] до окончания экспоненциальной фазы роста при температуре 30°С и перемешивании на вибростенде. Флавоноиды добавляли при внесении инокулята до исследуемой конечной концентрации в виде раствора в диме-тилформамиде.
Определение бактериостатической активности растворителей и растворов флавоноидов проводили методом радиальной диффузии препаратов в агаризованную питательную среду, на которую газоном высевали изучаемую культуру азоспирилл. По диаметру зон отсутствия роста де-
лали выводы об уровне бактериостатической активности флавоноида.
С поверхности клеток капсулу удаляли механическим перемешиванием в 0.15 М растворе NaCl в течение 6 сут со сменой отмывающего раствора через каждые 12 ч. Капсульный материал диализовали против дистиллированной воды в течение 2 сут, с использованием полупроницаемой мембраны с пределом исключения 12 кДа ("Sigma", США), концентрировали на роторном испарителе и лиофилизировали. Отмытые от капсулы клетки обезвоживали трехкратным центрифугированием в ацетоне и высушивали на воздухе.
ЛПСQ получали экстракцией высушенных ацетоном клеток, выращенных в присутствии кверцетина, 45% водным раствором горячего фенола без разделения слоев [19]. Очистку препаратов ЛПСQ и КПСQ от низкомолекулярных веществ проводили на колонках с Sepharose CL-4B и Sephadex G-50 ("GE Healthcare", США), как описано ранее [18]. Фракции, выходившие с нулевым объемом колонки и содержавшие углеводы, объединяли, концентрировали и лиофилизирова-ли. Детекцию продуктов разделения в элюатах осуществляли с помощью дифференциального проточного рефрактометра LKB 2142 ("LKB", Швеция), наличие углеводных компонентов оценивали по поглощению при X = 492 нм продуктов реакции элюата с фенолом и серной кислотой.
Дополнительную очистку полученных препаратов от кверцетина проводили экстракцией окрашенных метаболитов из подкисленных водных растворов гликополимеров пятикратным объемом этилацетата.
Для электофоретического скрининга влияния флавоноидов на бактерии проводили экстракцию ЛПС из биомассы клеток ЭДТА [20]. Электрофорез препаратов ЛПС и КПС выполняли в 15% ДСН-ПААГ [21]. Визуализацию компонентов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе азотнокислого серебра [22].
При иммунодоте наносили экстракты ЛПС на нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0.2 мкм ("Sigma", США). Свободные сайты свя-
HO
Кверцетин
OH
OH
OH O Mr 302.23
HO
Нарингенин
OH O Mr 272.25
OH
HO
Рутин
OH OH O—Glc-Rha
OH O Mr 610.52
Рис. 1. Структурные формулы флавоноидов, используемых в исследованиях.
зывания на мембране блокировали 1% обезжиренным молоком в течение 1 ч. Иммунодетекцию проводили, инкубируя доты с поликлональными кроличьими антителами к препаратам ЛПС и ЛПБК (АтЛПС и АтЛПБК) [12]. В качестве вторичных использовали козьи антикроличьи антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена ("Sigma", США), и визуализировали взаимодействие с использованием субстрата 3,3'-диаминобензидина.
Определение содержания в ЛПС углеводов, примесей белков и нуклеиновых кислот проводили с помощью общепринятых спектрофотомет-рических методов [18]. Метилирование жирных кислот выполняли согласно методике, описанной в работе [23]. Идентифицировали жирные кислоты методом ГЖХ по эталонным образцам фирмы "Sigma"(США) на хроматографе GC-2010 ("Shimadzu", Япония).
Анализ моносахаридного состава ПС проводили ГЖХ на хроматографе Hewlett Packard 5890 после предварительного гидролиза образцов 2 М CF3COOH (120°C, 2 ч), восстановления NaBH4 и ацетилирования [24]. Деление выполняли на капиллярной колонке НР-5 в градиенте температуры от 160°C (1 мин) до 290°C со скоростью нагрева 7°С/мин. Абсолютные конфигурации сахаров определяли при аналогичных условиях ГЖХ аце-тилированных гликозидов с ^)-2-октанолом [25].
Метилирование ПС проводили CH3I в диме-тилсульфоксиде и в присутствии метилсульфи-нилметанида. Затем ПС гидролизовали 2 М CF3COOH (120°C, 2 ч) и ацетилировали после восстановления NaBH4. Анализ частично метилированных ацетатов полиолов проводили ГЖХ-МС на хроматографе Hewlett Packard 5989A, снабженном капиллярной колонкой HP-5ms, в градиенте температуры от 150°C (3 мин) до 320°C со скоростью нагрева 5°С/мин.
Анализ методом спектроскопии ЯМР выполняли на спектрометре DRX-500 ("Bruker", Германия) в растворе 99.96% D2O при 27°C (внутренний стандарт — ацетон, SH 2.225, SC 31.45). Образцы предварительно лиофилизировали дважды из
99.9% Э20. Двумерные спектры регистрировали с использованием стандартного математического обеспечения компании "Вгакег" (Германия); для сбора и обработки данных использовали программу XWINNMR 2.1. В экспериментах TOCSY и NOESY время смешивания составляло 150 и 200 мс соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Интерес к флавоноидам — кверцетину, рутину и нарингенину, о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.