БИОЛОГИЯМОРЯ, 2013, том 39, № 5, с. 380-383
УДК 582.272.462+577.114:615.015.11 ФАРМАКОЛОГИЯ
ВЛИЯНИЕ ФУКОИДАНА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ БУРОЙ МОРСКОЙ ВОДОРОСЛИ SACCHARINA JAPONICA, НА АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ IN VITRO
© 2013 г. О. А. Шокур1, Ю. С. Хотимченко1'2
1Институт биологииморя им.А. В.ЖирмунскогоДВО РАН,Владивосток 690059; 2Школа биамедициныДалънееосточного федералъногоуниеерситета, Владивосток 690091
e-mail: olga_shokur@list.ru
Статья принята к печати 6.06.2013 г.
Фукоидан, выделенный из бурой морской водоросли Saccharinajaponica (= Laminariajaponica), в условиях in -vitro стимулировал спонтанную агрегацию тромбоцитов человека. На фоне воздействия индукторов агрегации -коллагена и АДФ, фукоидан дозозависимым образом замедлял процесс индуцированной агрегации тромбоцитов.
Ключевые слова: тромбоциты, фукоидан, Saccharinajaponica, агрегация.
The influence of fucoidan from the brown alga Saccharina japónica on the platelet aggregation in vitro.
O. A. Shokur1, Y. S. Khotimchenko1-2 ('A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059; 2School ofBiomedicine, Far Eastern Federal University, Vladivostok 690091)
Fucoidan isolated from the brown seaweed Saccharina japónica (= Laminaria japónica) in vitro stimulated the spontaneous aggregation of human platelets. Following the application of aggregation inducers such as collagen and ADP, fucoidan decreased the induced platelet aggregation in a dose dependent manner. (Biologiya Morya, 2013, vol. 39, no. 5, pp. 380-383).
Keywords: platelets, fucoidan, Saccharinajaponica, aggregation.
Фукоиданы составляют семейство фукозо-содер-жащих сульфатированных полисахаридов, обнаруживаемых в фибриллярных структурах клеточной стенки и во внеклеточном матриксе бурых водорослей (Усов, Билан, 2009). В качестве сырьевого источника можно рассматривать хорошо изученную в химическом отношении бурую морскую водоросль Saccharina japónica (J.E. Areschoug, 1851) C.E. Lane, C. Mayes, Draehl et G.W. Saunders, 2006, которую в морских акваториях Азиатско-Тихоокеанского региона заготавливают в промышленных масштабах (Fitton, 2011). Ранее было установлено, что главная цепь фукоидана, выделенного из S. japónica, построена из остатков Z-фукопиранозы, 75% которых связаны между собой а-1,3-связью, 25% соединены а-1,4 связью (Wang et al., 2010). Боковые цепи P-D-галактопиранозы находятся в положении С4 a-Z-фукопиранозы (35%), а фукоз-ные остатки - преимущественно в положении С2 (65%). Обнаружено присутствие небольшого количества нейтральных Сахаров, таких как манноза, глюкоза, рамноза, ксилоза и арабиноза (Xue et al., 2001; Zvyagintseva et al., 2003; Wang et al., 2010). Соотношение сульфатных групп к фукозе составляет от 1 : 1 до 1 : 3 (Honya et al., 1999; Zvyagintseva et al., 2003). Сульфатные группы занимают положения С4 и/или С2 в фукозе и СЗ и/или С4 в галактозе (Wang et al., 2010). Молекулярная масса нативного фукоидана достигает 200 кДа (Xue et al., 2001).
В последние годы на различных экспериментальных моделях были продемонстрированы разнообразные
биологические эффекты фукоиданов, среди которых действие на систему гемостаза вызывает особый интерес. Подробно изучено влияние фукоидана на коагуляцию и установлены основные механизмы его действия (Berteau, Mulloy, 2003; Zvyagintseva et al., 2003; Azevedo de et al., 2009). Вместе с тем, до сих пор нет единого мнения о влиянии фукоидана на тромбоцитарное звено гемостаза. Рядом авторов показано, что фукоидан повышает агрегацию тромбоцитов in vitro (Azevedo de et al., 2009; Manne et al., 2013), другие авторы указывают на выраженный антиагрегантный эффект (Deacon-Smith et al., 1985; Zhu et al., 2010). Считается, что каждый новый сульфатированный полисахарид, выделенный из водорослей, является новым веществом с уникальной структурой и характерной биологической активностью (Rocha et al., 2005).
Целью настоящей работы является исследование воздействия фукоидана, выделенного из бурой морской водоросли S. japónica, на спонтанную и индуцированную агрегацию тромбоцитов человека в условиях in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Выделение и характеристика фукоидана
Сбор водорослей проводили в б. Восток зал. Петра Великого (Японское море) в сентябре 2011 г. Высушенные слоевища измельчали при помощи гомогенизатора Уоринга. Измельченную водоросль обрабатывали 70% водно-спиртовым раствором в течение 2 ч при температуре 80°С. Полученный
ВЛИЯНИЕ ФУКОИДАНА
381
раствор сливали, оставшийся жом обезжиренных водорослей раскладывали на фильтровальной бумаге и оставляли до полного испарения спирта. Последующую экстракцию осуществляли раствором 0.15 Н HCl в течение 16 ч при постоянном перемешивании. Для достижения максимального выхода фу-коидана водорослевой жом повторно экстрагировали соляной кислотой в течение 6 ч. Экстракты объединяли, фильтровали через бязь и осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин; после нейтрализации натрия гидрокарбонатом проводили ультрафильтрацию на мембране с пределом эксклюзии 10 кДа. Полученный раствор обрабатывали четырехкратным объемом 70% этилового спирта. Образовавшийся осадок отделяли и высушивали в сушилке конвекционного типа (Lee et al., 2004).
Полученный полисахарид характеризовали по содержанию фукозы, сульфатных групп, Сахаров и белковых примесей. Содержание фукозы определяли спектрофотометри-ческим методом при двух длинах волн: 396 и 430 нм (Dische, Shettles, 1948). Суммарное содержание Сахаров измеряли фенол-сернокислым методом (Dubois et al., 1979). Количество сульфатных групп оценивали турбидиметрическим методом (Dodgson, 1961). Для определения белковых примесей использовали микробиуретовый метод (Itzhaki, Gill, 1964).
Исследование агрегации тромбоцитов
Плазму крови получали от 33 условно здоровых добровольцев - мужчин в возрасте 18-30 лет. Отбор крови проводили утром натощак в вакуэты, содержавшие в качестве антикоагулянта 3.8% раствор цитрата натрия. Для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами, кровь центрифугировали в течение 15 мин при скорости 200 g и температуре 20°С. Полученные образцы плазмы использовали в течение 2 ч. Описанная манипуляция была выполнена с соблюдением процедуры добровольного информированного согласия на участие в исследовании и одобрена Этическим комитетом Тихоокеанского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 27.12.2010 г.).
Исследование агрегации тромбоцитов проводили на двухканальном лазерном анализаторе агрегации 230LA (НПФ "БИОЛА", Россия). Образование агрегатов оценивали методом световой агрегатометрии (Born, 1962). В качестве индукторов агрегации использовали коллаген и АДФ ("Ренам", Россия) в конечной концентрации 0.1 мг/мл и 5 мкМ соответственно. Реакцию активировали внесением индуктора в плазму, богатую тромбоцитами (15 мкл индуктора на 300 мкл плазмы). Процесс образования агрегатов визуализировали графически. Уровень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы.
Образцы фукоиданов добавляли в объеме 15 мкл, в качестве контроля использовали плазму, в которую вносили дистиллированную воду. Конечные концентрации фукоидана при внесении в плазму составили 0.045, 0.09, 0.18 и 0.45 мг/ мл. Рассчитывая содержание фукоидана, исходили из среднего содержания фукозы в фукоидане, которое равно 50%, и выход фукозы умножали на 2 (Усов и др., 2001).
Статистическую обработку количественных данных проводили с использованием статистической программы Instat (Graph Pad Software Inc. USA, 2005), в анализе применяли непараметрический критерий Вилкоксона для парных выборок. Данные представлены в виде медианы (Me) и значений квартального диапазона (25%; 75%). Различия считали статистически значимыми при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В выделенном нами полисахариде концентрация фукозы составляла 38.2%, суммарное содержание Сахаров составляло 77.8%, эфирносвязанной серной кислоты -31%; содержание белка не превышало 10%.
С одной стороны, без добавления индукторов в плазму, обогащенную тромбоцитами, фукоидан вызывал слипание тромбоцитов, что регистрировалось повышением спонтанной агрегации. Светопропускание плазмы в контроле составляло 1.43% (0.87; 1.43). При внесении раствора фукоидана в концентрации 0.045 мг/мл светопропускание плазмы повышалось до 10.5% (9.86; 13.2); р = 0.0156. Препарат в дозе 0.18 мг/мл повышал светопропускание плазмы до 26.5% (24.1; 29.5); р = 0.0223. Полученные нами результаты подтверждаются литературными данными. Показано, что способность фукоидана повышать агрегацию тромбоцитов in vitro зависит от количества сульфатированных групп и молекулярной массы полисахарида (Durig et al., 1997; Azevedo de et al., 2009). Фракции с меньшим содержанием сульфатов активируют тромбоциты сильнее, чем высокосульфа-тированный фукоидан (Berteau, Mulloy, 2003). Бульшей способностью повышать спонтанную агрегацию обладают фракции с более высокой молекулярной массой (Azevedo de et al., 2009). Установлено, что активация тромбоцитов фукоиданом происходит через тирозин-киназазависимый путь, опосредованный гомологами рецепторов лекгинов С-типа (Manne et al., 2013).
С другой стороны, в экспериментах с индуцированной агрегацией тромбоцитов фукоидан проявлял выраженный антиагрегантный эффект. В нашем исследовании АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов при добавлении фукоидана уменьшалась дозозависимо относительно контрольных значений (см. таблицу). Так, при концентрации фукоидана 0.045 мг/мл светопропускание достоверно снижалось на 20.8%, а в дозах 0.18 и 0.45 мг/ мл - на 30.5 и 59.5% соответственно. При использовании коллагена в качестве индуктора агрегации фукоидана в концентрации 0.045 мг/мл уменьшал светопропускание плазмы на 24.7%, при концентрации 0.18 мг/мл - на 34.9%, при концентрации 0.45 мг/мл - на 61.1%. Таким
Максимальная степень индуцированной агрегации тромбоцитов под влиянием раствора фукоидана, выделенного из бурой морской водоросли $асскагта]аротса
Концентрация фукоидана, мг/мл Степень агрегации, %
АДФ, 5 мкМ коллаген, 0.1 мг/мл
0 (контроль) 0.045 0.09 0.18 0.45 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.