БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.2, c.202-205
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 577.353:616-003.821
ВЛИЯНИЕ ФУЛЛЕРЕНОВ C60 НА АМИЛОИДЫ X-БЕЛКА
© 2009 г. Л.Г. Марсагишвили*, А.Г. Бобылёв*, М.Д. Шпагина*, П.А. Трошин**,
З.А. Подлубная* ***
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМосковской области; **Институт проблем xимической физики РАН, 142432, Черноголовка Московской области; ***Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области
Поступила в p едакцию 28.11.08 г.
Методом электр онной микроскопии изучен ингибирующий эффект гидратированного фулле-р ена C60 HyFn и натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена C6oCi(C6H4CH2COONa)5 на формирование амилоидных фибрилл X-белком in vitro. Показано, что данные вещества не только разрушают зр елые амилоидные фибр иллы, но и предотвращают обр азование новых фибрилл. Это свойство фуллер енов, наноразмерных частиц, может быть использовано для р азр аботки новой медицинской нанотехнологии в тер апии амилоидозов.
Ключевые слова: скелетная мышца, X-белок, амилоиды, гидратированный фуллерен Сб0 HyFn, натриевая соль поликарбоксильного производного фуллерена Сб0С1( C6H4CH2COONa) 5.
Неограниченно растущие в разных органах и тканях амилоидные отложения играют центр альную роль в патогенезе болезней, от которых стр адают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера, Пар кинсона, диабет второго типа, синдром Дауна, системные амилоидозы, прионные амилоидозы и др.). Уже сейчас эти болезни - главная причина смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка в амилоиды и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно. Известно более 20 белков, обр а-зующих амилоидные фибриллы и участвующих в патогенезе амилоидозов [1]. Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют некоторые общие свойства: бета-складчатую структуру с отдельными бета-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями конго красным и тио-флавином Т [2,3]. Важно отметить, что большинство белков-предшественников амилоидов пр етер певают трансформацию типа «а-спираль - Р-складчатость», необходимую для образования амилоидных фибрилл.
Нами впервые открыта способность мышечных цитоскелетных белков семейства тайтина (тайтин, C-, X- и Н-белки) [4] формировать амилоиды. Эти белки составляют 15% от общего количества белка в саркомере, занимая третье место после миозина (~40%) и актина
(~20%). Белки семейства тайтина участвуют в фор мировании структуры саркомера и в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении. Молекулы белков семейства тайтина имеют 90% бета-складчатой структуры, необходимой для формирования амилоидов. C помощью электронной микроскопии было показано, что исследуемые белки способны формировать структуры, сходные с амилоидными агрегатами известных амилоидных белков [1,5-8]; в частности X-белок образует спирально скр ученные ленточные фибриллы подобно АР-пептидам, играющим важную роль в развитии болезни Альцгеймера. Амилоидная природа агрегатов, образуемых белками семейства тайтина, была доказана стандартными тестами на амилоиды с использованием конго красного и тиофлавина Т. По ср авнению с другими амилоидными белками, требующими предварительной трансформации их структуры в бета-складчатую в жестких условиях, белки семейства тайтина легко образуют амилоиды в условиях, близких к физиологическим, что является их преимуществом при исследовании амилоидогенеза in vitro.
Предупреждение амилоидозов, их выявление на ранних стадиях и назначение своевременного эффективного лечения продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины. Ее успешное решение во многом зависит от фундаментальных знаний процесса амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирую-
щих их обр азование и разрушение, их влияния на жизнедеятельно сть клеток, разных тканей и ор ганов и т .д. В на стоящее вр емя ведутся интенсивные работы по поиску препаратов, разрушающих амилоидные фибриллы. Известны вещества, которые показали свою антиамилоидную способность in vitro. Среди них гепарин, апомор фин, тиникамицин, тетр ациклин и другие, но в клинической практике они пока не пр именяются [9-12]. И спользуемые в настоящее время лекарственные препараты приносят больным лишь временное облегчение. Отсутствие окончательных представлений об этиологии и патогенезе амилоидозов тормозит разработку эффективных подходов для терапии этого заболевания.
Р анее мы показали антиамилоидное действие тетр ациклина на амилоиды X-белка, сходное с действием этого антибиотика на А ß-пеп-тид [9,13]. В этой работе проведено электронно-микроскопическое изучение влияния гидра-тир ованного фуллер ена Сб0 HyFn (hydrated ful-lerene) и натриевой соли поликарбоксильного производного фуллерена C60Cl(C6H4CH2COONa)5 на фо р мир ование амилоидных фибр илл X-белком in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение белка. X-белок был выделен из скелетных мышц кролика по методу [14]. Чистоту белковых пр епар атов пр оверяли с помощью Д C Н-гель-электр офор еза по методу [15] с небольшими модификациями [16], котор ые способствовали лучшему фокусир ованию белковых поло с в геле. Концентр ацию белка опр еделяли спектрофотометрически, с использованием коэффициента экстинкции (E2м8г0мл) 1,09 [17].
Образование фибрилл X-белка и их разрушение . Для обр азования фибр илл р а створ белка в молекулярной форме был диализован в течение 18 ч пр и 4°C пр отив ра створ а, содер жа-щего: 30 мМ KCl, 10 мМ имидазол-HCl, рН 7,0. Образовавшиеся фибриллы обрабатывали фуллереном C60 HyFn и поликарбоксильным пр оизводным фуллер ена C60Cl(C6H4CH2COONa)5 в весовом соотношении белка к веществу 1:1 в течение суток пр и 4°C.
В работе были использованы фуллер ен C60 HyFn, полученный в Институте тер апии Укр а -инской АМН по методу Г .В. Андр иевского, и натр иевая соль поликар боксильного пр оизвод-ного фуллер ена C60Cl(C6H4CH2COONa)5, полученная в Институте проблем химической физики РАН по методике, опубликованной ранее [18].
Р ис. 1. Фуллер ен С60 - пр ед ставитель нового класса углер одных наномолекул. Молекула фуллер ена Сбо имеет фор му пр авильного усеченного икосаэдр а, в котор ом атомы углер ода располагаются на сфер и-ческой поверхности в вер шинах 20-ти пр авильных шестиугольников и 12-ти пр авильных пятиугольников так, что каждый шестиугольник гр аничит с тр емя шестиугольниками и тр емя пятиугольниками, а каждый пятиугольник гр аничит только с шестиугольниками. Вследствие этого каждый атом угле-р ода в молекуле Сбо находится в вер шинах двух шестиугольников и одного пятиугольника и пр ин-ципиально неотличим от других атомов углер ода. Диаметр молекулы Сбо равен пр имер но 0,71 нм (и это пр и молекуляр ной массе 720 Да).
Электронная микроскопия. Подготовку образцов для электронно-микроскопических наблюдений проводили согласно работе [4]. Обр азцы исследовали на электр онном микр о скопе 1ЕМ-100В п р и ускор яющем напр яжении 80 кВт и с объективной апертур ой 35 мкм. Микр офо-тогр афии были получены пр и увеличении 50000х. Увеличение микр о скопа было калибр о -вано по пар акр исталлам пар амиозина с о севой периодичностью 14,5 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом электронной микроскопии обнаружена спо собность нанор азмер ных частиц фуллер ена С60 НуБи (рис. 1) и натр иевой соли поликарбоксильного производного фуллер ена С60С1(С6Н4СН2СООМа)5 разрушать амилоидные фибриллы, формируемые Х-белком (рис. 2). Согласно нашим наблюдениям в препаратах фуллер ена С60 НуБи пр исутствовали сфер иче-ские агр егаты диаметр ом 5-40 нм (рис. 3б). Таких агрегатов мы не наблюдали в препаратах С60С1(С6Н4СН2СООМа)5 (р ис. 3в), относящихся к водор аствор имым пр оизводным фуллер ена [18]. Добавление фуллер ена С60 НуБи к спирально скрученным лентам Х-белка приводит к их деко р ации сфер ическими агр егатами фуллер ена, уменьшению длины и ширины лент. С формированные фибриллы Х-белка имеют о севую пер иодично сть ~ 60-70 нм и шир ину ~ 40 нм (р ис. 3а), а пр и связывании с фулле-р еном шир ина уменьшается до 10 нм (р и с. 3г ,д). Более того, Х-белок в молекуляр ной фор ме в
204
МАРСАГИШВИЛИ и др.
P ис. 2. Натр иевая соль поликар боксильного пр о -изводного фуллерена - C6oCl(C6H4CH2COONa)5.
присутствии фуллер ена C60 не формирует амилоидных фибр илл. В отличие от фуллер ена C60 HyFn добавление C60Cl(C6H4CH2COONa)5 к спирально скрученным ленточным фибриллам X-белка приводит к разрушению амилоидных фиб р илл X-белка до отдельных молекул (рис. 3е). Фуллерены C60 HyFn и C60Cl(C6H4CH2COONa)5
не только разрушают зр елые амилоидные фибр иллы, но и пр едотвр ащают обр азование новых фибрилл. Это важно, поскольку сегодняшняя пр евентивная стр атегия медицины о снована в том числе и на идее пр едотвр ащения пер ехода мягких когнитивных нарушений и начальных фор м болезни Альцгеймер а в развитые фо р мы этого заболевания.
В последнее время тестируются in vivo антиамилоидные и токсические свойства фулле-р ена C60 и его ра створ имы х в воде пр оизводных соединений как потенциальных лекарственных препаратов [19,20]. Показано, что введение в мозг кр ы сам фуллер ена C60 HyFn положительно влияет на когнитивные пр оцессы в нор ме [21]. Этот результат свидетельствует об отсутствии нейротоксично сти фуллер ена C60 HyFn. Пр о -демонстр ир овано соответствие между антиамилоидным действием фуллер ена C60 HyFn in vitro [22] и его способностью пр едотвр ащать нарушение когнитивных процессов, индуцируемое амилоидами А в (25-35)-пептида у экспер имен-тальных животных [23]. Поскольку нами пока -зано сходное антиамилоидное действие фулле-рена C60 HyFn [22] на амилоиды Ав-пептида
Р ис. 3. Электр онные микр офотогр афии: (а) - спир ально скрученные ленточные фибр иллы Х-белка, сфор мир о -ванные в растворе, содержащем 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7,0; (б) - сферические агрегаты гидрати-рованного фуллерена С6о ИуБи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.