НЕЙРОХИМИЯ, 2004, том 21, № 1, с. 34-38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.175.82+575.1
ВЛИЯНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО НОКАУТА МОНОАМИНОКСИДАЗЫ А НА КАТЕХОЛАМИНЫ И СЕРОТОНИН В СТРУКТУРАХ МОЗГА МЫШЕЙ
© 2004 г. Н. К. Попова1*, М. А. Гилинский2, Т. Г. Амстиславская1, Е. А. Морозова1, И. Сейф3
1Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия 2Институт физиологии Сибирского отделения РАМН, Новосибирск, Россия 3Националъный центр научных исследований, Институт Кюри, Орсэ, Франция
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии изучено влияние генетического нокаута моноаминоксидазы А (МАО А) - одного из основных ферментов катаболизма серотонина и ка-техоламинов, на уровень серотонина, его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК), норадреналина, дофамина и его метаболита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) в стриатуме, среднем мозге, гипоталамусе, гиппокампе, фронтальной коре и миндалине. Показано, что мыши линии Tg8 с необратимо разрушенным геном МАО А отличаются от мышей исходной линии C3H/HeJ более высоким уровнем норадреналина и серотонина и пониженным уровнем 5-ГИУК во всех структурах мозга, кроме фронтальной коры. Дофамин был умеренно повышен только в стриатуме, хотя концентрация ДОФУК была значительно снижена в стриатуме, среднем мозге, гипоталамусе и гиппокампе, что свидетельствует об эффективности компенсаторных процессов в до-фаминергической системе мозга.
Результаты дают основание полагать, что относительная роль МАО и МАО В в метаболизме кате-холаминов и серотонина в разных структурах мозга различна. Фронтальная кора более устойчива к отсутствию МАО А, чем другие структуры мозга.
Ключевые слова: генетический нокаут МАО А, серотонин, норадреналин, дофамин, структуры мозга.
Одно из новейших достижений молекулярной биологии - методология генетического нокаута специфических генов, позволяет получать линии мышей с необратимым повреждением конкретного гена и, соответственно, с отсутствием соответствующего специфического белка [1, 2]. Это расширяет возможности для изучения функции биологически активных веществ белковой природы, а для классических медиаторов, которые не являются белками, таких элементов, как рецепторы и ферменты метаболизма.
По сравнению с имевшимися методами стратегия генетического нокаута обладает определенными преимуществами, основными из которых являются: 1) селективность выключения специфического гена, ведущего к исчезновению из организма конкретного фермента или рецептора; 2) целенаправленное моделирование наследственной патологии, связанной с мутацией отдельных генов, что открывает новые перспективы для изучения механизмов ее компенсации и терапии [3, 4].
* Адресат для корреспонденции: 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, д. 10; тел.: (383) 232-31-01; e-mail: npopo-va@bionet.nsc.ru
Мыши с генетическим нокаутом МАО А [5] привлекают особое внимание, так как эта модель соответствует наследственной патологии, обнаруженной у человека. Десять лет назад было выявлено голландское семейство с наследственной недостаточностью МАО А [6]. У всех пяти мужчин этого семейства с синдромом пограничной умственной недостаточности и проявлением импульсивной агрессии была идентифицирована точковая мутация в восьмом экзоне структурного гена МАО А. Далее было обследовано четыре поколения этого обширного семейства, в котором было обнаружено 14 мужчин со сходным поведенческим синдромом, характеризующимся пограничной умственной недостаточностью и изменениями поведения, среди которых наиболее постоянной была импульсивная агрессивность [7].
МАО (амин: кислород-оксидоредуктаза дез-аминирующая, флавиносодержащая, КФ 1.4.3.4) существует, как известно, в двух формах - МАО А и МАО В, которые различаются субстратной и ингибиторной специфичностью [8] и кодируются разными, близко расположенными на Х-хромосо-ме генами [9]. Поскольку клеточное распределение МАО А и МАО В у грызунов и приматов сходно, предполагается, что и физиологическая
функция этих изоформ сходна [10]. МАО А является основным ферментом катаболизма серото-нина и одним из основных ферментов катаболизма норадреналина. Хотя считается, что дофамин является смешанным субстратом для МАО А и МАО В, относительная роль этих изоферментов у разных видов животных различна. Полагают, что у мышей в нормальных условиях дофамин ме-таболизируется преимущественно МАО А, тогда как участие МАО В становится существенным при компенсаторном переключении метаболических путей [11]. У половозрелых мышей с генетическим нокаутом МАО А изменений в уровне дофамина в целом мозге не отмечено, хотя наблюдалось существенное увеличение его метаболита ДОФУК [5]. Нами было показано, что у мышей с генетическим нокаутом МАО А относительное понижение показателя окислительного дезами-нирования серотонина - отношения уровня его основного метаболита 5-ГИУК к серотонину, было сходным во всех структурах мозга, кроме коры, где оно было меньшим [12]. Несомненный интерес представляет сопоставление уровня и метаболизма дофамина, серотонина и норадреналина в разных отделах мозга при наследственном отсутствии важного фермента их деградации. Таких данных в литературе не имеется.
Цель настоящего исследования - изучение влияния генетического нокаута МАО А на уровень серотонина, его метаболита 5-ГИУК, норадреналина, дофамина и его метаболита ДОФУК в стриатуме, среднем мозге, гипоталамусе, гиппо-кампе, фронтальной коре и миндалине мозга мышей.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на трансгенных мышах линии Т§8 с необратимо разрушенным геном МАО А и мышах линии С3/Не1 (С3Н), из которых была создана линия Т§8 [5]. Линии мышей были получены из Института Кюри (Франция) и поддерживались селекцией в Институте цитологии и генетики СО РАН. Мыши были в возрасте 4 мес., массой около 25 г. Животные содержались в группах по 4 самца и самки и были изолированы для снятия "группового эффекта" за 5 дней до опыта. Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с Директивой Совета Европейского Сообщества (86/609/ЕЕС, 24.11.1986 года). Для определения уровня норадреналина, серотонина, 5-ГИУК, дофамина и ДОФУК мыши были быстро декапитированы между 10-11 ч; средний мозг, стриатум, фронтальная кора, миндалина, гиппокамп, гипоталамус выделялись на льду и немедленно гомогенизировались в 0.1 М хлорной кислоте, содержавшей 100 нг/мл изопро-пилнорадреналина в качестве внутреннего стандарта.
Содержание моноаминов в образцах ткани мозга определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией. Разделение моноаминов проводили на колонке из нержавеющей стали длиной 60 мм, с внутренним диаметром 2 мм, упакованной обращенно-фазовым сорбентом Nucleosil C18, 5 мкм. В качестве подвижной фазы применялся водный раствор 0.05 М однозамещенного фосфата калия, 0.05 М лимонной кислоты, 0.15 г/л ок-тилсульфоната натрия ("Sigma", США) и 60 мг/л ЭДТА. Подача элюента осуществлялась со скоростью 90 мкл/мин насосом хроматографа "Ми-лихром-1" ("Научприбор", г. Орел). Потенциал рабочего электрода электрохимического детектора устанавливался равным +0.6 В относительно хлорсеребряного референтного электрода. Метод детально описан ранее [10].
Статистическая обработка проведена двух-факторным анализом ANOVA с использованием в качестве основных факторов линий мышей (контроль и МАО А нокаут) и структур мозга (средний мозг, стриатум, фронтальная кора, гипоталамус, миндалина, гиппокамп). При выявлении взаимодействия эффекта факторов данные для отдельных мозговых структур сопоставляли с использованием ¿-теста Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Были выявлены существенные различия во влиянии генетического нокаута МАО А на метаболизм и содержание серотонина, дофамина и норадреналина в различных структурах мозга мышей (рисунок). У мышей с генетическим нокаутом МаО А уровень серотонина был повышен (F1106 = 40.4, p < 0.001), а уровень его основного метаболита 5-ГИУК - снижен (F1106 = 36.2, p < 0.001) во всех исследованных структурах мозга, за исключением фронтальной коры, изменения в которой не были существенными (таблица).
Значительные изменения у мышей, лишенных МАО А, обнаружены в содержании норадреналина. Концентрация норадреналина у мышей с генетическим нокаутом МАО А значительно превышала соответствующие его концентрации у мышей контрольной линии С3Н (F1106 = 88.9, p < < 0.001). Уровень норадреналина у мышей линии Tg8 значительно увеличен в среднем мозге, гип-покампе, гипоталамусе, миндалине и стриатуме. Единственной областью мозга, где не было обнаружено изменений в содержании норадреналина, явилась фронтальная кора. Установлено высокозначимое влияние фактора "структура мозга" (F5106 = 196.4, p < 0.001) и взаимодействие факторов "структура мозга" и "линия мышей" (F5106 = = 28.6, p < 0.001). Наибольшее увеличение по сравнению с контролем было отмечено в стриа-туме, среднем мозге и гипоталамусе.
36
ПОПОВА и др.
Серотонин, 2400
2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
нг/г
й
й
X
I
*
* *
8
Л
В отличие от серотонина и норадреналина, генетический нокаут МАО А не оказал значительного влияния на содержание дофамина в структурах мозга за исключением стриатума, в котором отмечено умеренное его увеличение. В то же время уровень ДОФУК значительно снизился в большинстве отделов мозга, за исключением миндалины и фронтальной коры, где была отмечена лишь тенденция к ее понижению (таблица). Найдены существенные различия в уровне ДОФУК между линиями мышей (^1106 = 124.7, р < 0.001), структурами мозга (Р5.106 = 84.5, р < < 0.001). Было выявлено и взаимодействие этих факторов (^5.106 = 42.7, р < 0.001).
Норадреналин, нг/г 4000
3000
2000 400 200 0
I
%
8
*
** ** *
*
X
Дофамин, нг/г 12000
гЧ
8
д.,
¿к
я
1
10000 8000 6000
400
200
0
Уровень серотонина, норадреналина и дофамина в структурах мозга контрольных мышей и мышей с генетическим нокаутом МАО А.
Условные обозначения. Белые столбики - контроль (линия С3Н), полосатые столбики - линия Tg8 с генетическим нокаутом МАО А.
1 - стриатум, 2 - гиппокамп, 3 - миндалина,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.