научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА И КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ НА ЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР КАПУСТЫ КИТАЙСКОЙ BRASSICA RAPA SSP. СHINENSIS СОРТА ЛАСТОЧКА Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА И КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ НА ЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР КАПУСТЫ КИТАЙСКОЙ BRASSICA RAPA SSP. СHINENSIS СОРТА ЛАСТОЧКА»

= ГЕНЕТИКА =

УДК 573.6:635.345

ВЛИЯНИЕ ГЕНОТИПА И КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ НА ЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР КАПУСТЫ КИТАЙСКОЙ Brassica rapa ssp. chinensis СОРТА ЛАСТОЧКА © 2015 г. Д. В. Шумилина, Н. А. Шмыкова, Л. Л. Бондарева, Т. П. Супрунова

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур, 143080 Московская обл., Одинцовский р-н, пос. ВНИИССОК, ул. Селекционная, 14

E-mail: dasha2409@yandex.ru Поступила в редакцию 12.05.2014 г.

Проведены исследования влияния различных факторов на эффективность эмбриогенеза в культуре микроспор капусты китайской. Установлено, что на формирование эмбриоидов сильно влияет генотип отдельного растения. Наибольшее число эмбриоидов и нормальных растений получено в опытах с культивированием микроспор из бутонов длиной 2—2.9 мм в жидкой питательной среде Лихтера (NLN) с 13% сахарозы и добавлением 24-эпибрассинолида и 1% активированного угля. Отмечено, что выращивание эмбриоидов на питательной среде Мурасиге—Скуга с половинным содержанием солей (1/2 МС) с 2% сахарозы, 0.1 мг/л бензиламинопурина и 3 г/л фитогеля стимулировало образование вторичных эмбриоидов, что позволило получить большое число удвоенных гаплоидных растений.

DOI: 10.7868/S000233291504013X

Гаплоидные растения имеют большое значение для количественного генетического анализа, изучения взаимодействия генов, генетической изменчивости, определения групп сцепления, картирования популяций, а также в селекции для получения чистых линий. Основой получения гаплоидов является культура микроспор in vitro, которая занимает ведущее место в селекционных программах по ускорению процесса создания высокопродуктивных гибридов и сортов сельскохозяйственных растений. Изолированные микроспоры при определенных условиях могут быть переведены с нормального гаметофитного пути развития на спорофитный. При этом образуются эмбриоиды, которые развиваются в гаплоидные (Hs) или в удвоенные гаплоидные растения (DH).

Капуста китайская Brassica rapa ssp. ^inensis — одна из главных овощных культур в Азии, а в России листовые формы китайской и пекинской капусты приобретают все большую популярность. Селекция капусты китайской ориентирована в основном на создание гибридов F1, для которых требуются константные линии с высокой комбинационной способностью. Обычно такие линии получают путем инбридинга в течение 6—8 поколений, поэтому разработка методики получения гомозиготных линий в культуре микроспор за одну регенерацию — актуальная задача. Несмотря на то что уже опубликованы статьи по регенерации из изолированных микроспор B. rapa ssp. oleifera (Lichter, 1989; Baillie et al, 1992; Burnett et al, 1992; Ferrie et al., 1995; Guo, Pulli, 1996), B. rapa ssp. pe-

kinensis (Sato et al., 1989; Kuginuki et al., 1997), B. rapa ssp. chinensis (Cao et al., 1994) и B. rapa ssp. parachinensis (Wong et al., 1996), универсальной эффективной технологии получения удвоенных гаплоидных растений (DH-технологии) не существует. В литературе отмечается, что подвид B. rapa ssp. chinensis наименее отзывчивый в культуре микроспор среди представителей вида B. rapa.

Одна из задач DH-технологий — получение как можно большего числа гаплоидных растений, так как это позволяет наиболее полно охватить спектр генетических рекомбинантных форм, в том числе с рецессивными признаками. Наиболее значимый элемент DH-технологии, позволяющий увеличить выход растений-регенерантов, — повышение индукции эмбриогенеза микроспор. Некоторые параметры DH-технологии (выращивание донорных растений при пониженных температурах, применение тепловой обработки микроспор в первые дни культивирования (Lo, Pauls, 1992; Cegielska-Taras et al., 2002), использование сред с высоким содержанием сахарозы (Baillie et al., 1992; Ilic-Grubor et al., 1998; Ferrie et al., 1999; Lionneton et al., 2001)) для рода Brassica универсальны. Согласно опубликованным данным эффективность эмбриогенеза зависит и от таких факторов, как генотип растения, стадия развития микроспор, тип предобработки бутонов и микроспор, состав питательных сред, условия культивирования (Ferrie et al., 1995).

Цель работы — изучение влияния генотипа индивидуального растения, фазы развития микро-

спор, 24-эпибрассинолида и активированного угля на число эмбриоидов и выход нормальных рас-тений-регенерантов B. rapa ssp. chinensis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Была использована капуста китайская B. rapa ssp. chinensis сорта Ласточка селекции ВНИИС-СОК. Донорные растения выращивали в климатической камере при 15°С круглосуточно, 16С8Т, где С — светлое время (день), Т — темное, освещение — 9000 лк. При отборе бутонов проводили цитологическое исследование стадий развития микроспор. Для визуализации микроспор и пыльцы использовали методику дифференциального окрашивания (Alexander, 1969) и микроскоп Axio Imager А2 (Zeiss, Германия), с помощью которых определяли зависимость между размером бутона и стадией развития микроспор.

Для культуры микроспор бутоны собирали с растений, находящихся на начальной стадии цветения, и стерилизовали в течение 30 с в 96%-ном этаноле, затем в течение 5 мин в 50%-ном водном растворе коммерческого препарата "Белизна" (Россия) с добавлением Tween 20 (Panreac, Испания) 1 капля на 100 мл раствора, с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде.

Стерильные бутоны помещали в среду Лихтера с половинным содержанием компонентов (V NLN), рН 5.8 (Lichter, 1982), с 13%-ным содержанием сахарозы (из расчета 30 бутонов на 6 мл среды) и измельчали на магнитной мешалке. Суспензию микроспор пропускали через нейлоновый фильтр с размером ячеек 40 мкм и осаждали в течение

5 мин на центрифуге типа Eppendorf 5804R (Германия) при 125 g. Осадок с микроспорами ресус-пендировали в среде V NLN, после чего повторяли центрифугирование. Промывку микроспор проводили дважды.

После выделения и промывки микроспоры из 10 бутонов помещали в чашки Петри диаметром

6 см с питательной средой вышеприведенного состава (5 мл), в которой они инкубировались при 32°С в темноте в течение 2 сут. Далее инкубация проходила при 25°С в темноте до образования эмбриоидов.

Для определения оптимальной стадии развития бутона и микроспор суспензию микроспор готовили из бутонов длиной 2—2.9 или 3—4 мм. Опыт проводили дважды с четырехкратной по-вторностью каждого варианта.

Для изучения влияния генотипа растения на индукцию эмбриогенеза в культуре микроспор использовали три растения капусты китайской сорта Ласточка, с которых собирали бутоны в индивидуальном порядке. Суспензию микроспор готовили из бутонов длиной 2—2.9 мм. Опыт про-

водили дважды с четырехкратной повторностью каждого варианта.

Для изучения влияния 24-эпибрассинолида (EpB) и активированного угля (АУ) на развитие эмбриоидов в культуре микроспор использовали бутоны длиной 2—2.9 мм, собранные с 10 растений. Для культивирования микроспор применяли среду A NLN с 13% сахарозы. В опытах с АУ в каждую чашку Петри до разлива жидкой среды вносили по 250 мкл автоклавированной 1%-ной суспензии АУ в 0.5%-ной агарозе. В опытах с брассиностероидом (BR) использовали 1 мМ стоковый раствор EpB (Duchefa, Чехия) в диметил-сульфоксиде, который добавляли в питательную среду непосредственно в чашки Петри до конечной концентрации 0.4 х 10-7 М.

Эксперимент включал в себя следующие варианты обработок: контроль (A NLN с 13% сахарозы без добавок); внесение АУ в 1-е сут культивирования; внесение EpB в 1-е сут культивирования; внесение EpB и АУ в 1-е сут культивирования; внесение EpB на 3-и сут культивирования; внесение EpB и АУ на 3-и сут культивирования.

Появившиеся эмбриоиды на стадии крупных глобул, а также в сердцевидной или торпедовид-ной фазах своего развития помещали в чашки Петри на среду Гамборга (В5) (Gamborg, 1968), содержавшую 0.5% сахарозы, 0.5% глюкозы и 3 г/л фитогеля. Для образования вторичных эмбриоидов экспланты переносили на среду A МС (Mu-rashige, Skoog, 1962) с 2% сахарозы, 0.1 мг/л бен-зиламинопурина (БАП) и 3 г/л фитогеля. Образовавшиеся побеги и эмбриоиды отделяли и переносили на среду A МС с 2% сахарозы и 3 г/л фитогеля. Культивирование проводили на стеллажах с люминесцентными лампами при 25°С, фотопериоде 14 ч и освещенности 2500 лк.

Растения с нормально развитыми листьями и корневой системой переносили в вегетационные сосуды, заполненные смесью торфа и перлита (7 : 3), накрывали перфорированными пластиковыми стаканчиками для адаптации растений к условиям in vivo. Растения-регенеранты выращивали в тех же условиях, что и донорные растения.

Определение плоидности у растений-регене-рантов проводили путем подсчета хлоропластов в замыкающих устьичных клетках, поскольку у растений число хлоропластов коррелирует с числом хромосом, т.е. у диплоидных растений число хлоропластов примерно вдвое меньше, чем у гаплоидных (Монахос и др., 2014). Эпидермальный слой клеток снимали с нижней стороны листьев и промывали в дистиллированной воде, затем его помещали на предметное стекло в каплю воды, накрывали сверху покровным стеклом и просматривали под микроскопом Axio Imager А2 с флуоресценцией (набор фильтров BR 490 и 515). Были сфотогра-

Рис. 1. Микроспоры капусты китайской сорта Ласточка,

выделенные из бутонов длиной 2—2.9 (а) и 3—4 мм (б).

фированы не менее 10 пар устьичных клеток каждого растения и подсчитаны хлоропласты.

Статистический анализ был проведен с помощью программы ANOVA (Gomez, Gomez, 1984) — One way ANOVA, Factorial ANOVA и Теста Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Успех в получении гаплоидных эмбриоидов в культуре in vitro напрямую связан со стадией развития микроспор. Известно, что у растений рода Brassica способностью перехода с гаметофитного пути на спорофитный обладают микроспоры поздней одноклеточной стадии и пыльцевые зерна ранней двухклеточной стадии развития (Pechan, Keller, 1988; Baillie et al, 1992; Telmer et al, 1992; Kott, 1998).

Проведенный цитологический анализ показал, что наибольшее число микроспор, потенциально способных к эмбриогенезу, находится в бутонах длиной 2—3 мм (рис. 1). В культуре микроспор при использовании бутонов длиной от 2 до 3 мм н

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»